ctcs - Repositorio de la Universidad de Jaen - Universidad de Jaén

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UNIVERSIDAD DE JAÉN FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA SALUD

TESIS DOCTORAL

UTILIDAD PRONÓSTICA DE LA DETECCIÓN DE CÉLULAS TUMORALES CIRCULANTES (CTCS) EN PACIENTES CON TUMORES SÓLIDOS DE ORIGEN EPITELIAL

PRESENTADA POR:

MARÍA CAMPOS SEGURA DIRIGIDA POR:

DR. D. JOSÉ JUAN GAFORIO MARTÍNEZ JAÉN, 25 DE MAYO DE 2012 ISBN 978-84-8439-664-2 DEPÓSITO LEGAL J-1209-2012

Área de Inmunología Departamento de Ciencias de la Salud Facultad de Ciencias Experimentales Universidad de Jaén

Utilidad pronóstica de la detección de células tumorales circulantes (CTCs) en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Tesis Doctoral María Campos Segura 2012

Utilidad pronóstica de la detección de células tumorales circulantes (CTCs) en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Memoria para optar al grado de Doctor Jaén, 2012

Fdo: María Campos Segura Aspirante al Grado de Doctor

El Director del trabajo: Fdo: José Juan Gaforio Martínez

Área de Inmunología. Departamento de Ciencias de la Salud Facultad de Biología Experimental. Universidad de Jaén

D. José Juan Gaforio Martínez, perteneciente al Área de Inmunología del Departamento de Ciencias de la Salud de la Universidad de Jaén CERTIFICA:

Que el trabajo expuesto en la presente Tesis Doctoral: “Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial” presentado por Dª. María Campos Segura ha sido realizado bajo mi dirección y supervisión, cumpliendo así mismo todas las exigencias para su presentación y defensa para optar al grado de Doctor. Parte del trabajo presentado ha sido realizado durante la estancia de la doctoranda en el Laboratorio de Nuevas Dianas Terapéuticas, de la División de Oncología del Centro de Investigación Médica Aplicada (CIMA) de Pamplona.

Jaén, 3 de marzo de 2012 Fdo: José Juan Gaforio Martínez

Este trabajo ha sido subvencionado por el Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Ciencia e Innovación, (FIS 02/1879, Grupo PAI CTS-442), la Fundación de Investigación Médica Mutua Madrileña (II Convocatoria de Ayudas a Proyectos de Investigación Médica, 2004), la Convocatoria de Becas y Ayudas para la Formación de Doctores y del Personal Docente e Investigador en las Universidades y Centros de Investigación de Andalucía (Orden de 31 de marzo de 2003; BOJA número 68), con cargo al cual la doctoranda ha disfrutado de una beca de formación de personal investigador así como de ayudas para la realización de la estancia en otro centro de investigación, y la Convocatoria de Incentivos para la Contratación Laboral de Personal Beneficiario de Becas y Ayudas para la Formación de Doctores y del Personal Docente e Investigador (Orden de 25 de noviembre de 2005; BOJA número 240), con cargo al cual la doctoranda ha disfrutado de un contrato de formación de personal investigador.

A mis padres, a mis hermanos y a Sergio

A Jose

Esta tesis ha sido obra del esfuerzo propio y de la colaboración de un grupo de gente, que con su trabajo y/o apoyo me han permitido conseguir este fin. Por lo tanto quiero agradecer al personal que forma parte de la Universidad de Jaén (UJA), del Hospital Universitario de Jaén y al Centro de Investigación Médica Aplicada (CIMA) de Pamplona. Especialmente quiero dar las gracias a mi director de tesis, el Dr. José Juan Gaforio, por iniciarme en este mundo de la investigación, por estimular mi materia gris y ensañarme a aplicar el método científico. A Fernando Warleta Arias, aunque yo lo conocí como Arias Warleta, por soportar el día a día conmigo y aún así mantener nuestra amistad, por compartir una etapa trascendental en mi vida, por imaginar negocios imposibles y por ser simplemente “él”. A mis “compis” Jesús Ruiz-Mora y Nicolás de la Torre, por enseñarme que siempre hay otros caminos, y a Cristina SánchezQuesada, como firma en los artículos, por ser lo que hacía falta en los últimos momentos para ayudarme a dar ese empujón y saltar. A los compañeros de Microbiología, especialmente Pilar Viedma, María José Grande y Hikmate Abriouel, y a los becarios del “despacho 209”, una combinación única con su propia idiosincrasia, por lo que hemos compartido. A Ignacio Algarra y Margarita García, dos refuerzos emocionales que te hacen ver las cosas desde otra perspectiva. A Pilar Iglesias, Antonio Luis Sancho y Ángela Ortiz, tres personas fantásticas. A Miguel Delgado, por atender y sufrir todas mis dudas y preguntas, por esas mañanas interminables donde quiso hacerme “volver a entender” la estadística.

A la “gente” del CIMA, especialmente Alfonso Calvo, Raúl Catena y Maribel Zudaire, y a aquellos con los que, aunque no trabajé directamente, conviví y fueron muy importantes durante esos seis meses (Erik Oliemuller, Inmaculada López, Paul Alain Nguewa, Ana Fernández, Jackeline Agorreta, María José Pajares, Carlos Ortiz de Solórzano, David García, y otros que me dejo en el tintero). A mis amigos Rocío Tiscar y Pedro Sagra, por haber sido “oídos” para mí. A mis padres, por apoyarme sin condiciones, por involucrarse, por ser inspiración, por ser “motor”, por todo, y aún así no digo nada. A mis hermanos, por ser ejemplo de superación personal y una de mis metas en la vida. A Sergio, por querer que terminase este “libro”. Al resto de mi familia por su apoyo y “fuerza”. A Jose, por haber estado ahí, siempre ahí. Mi “pequeña y persistente” luz en la oscuridad. A todos ellos y a los que no he nombrado. Gracias

Dadme un punto de apoyo y moveré el mundo (ARQUÍMEDES) 287-212 a.C.

La explicación más simple y suficiente es la más probable, mas no necesariamente la verdadera La navaja de Ockham (GUILLERMO DE OCKHAM) 1285-1349

ABREVIATURAS

Abreviaturas Utilidad pronóstica de la detección de células tumorales circulantes (CTCs) en pacientes con tumores sólidos.

µm

micrómetro

AJCC

Comité Conjunto Americano del Cáncer, acrónimo derivado de su nombre en inglés (American Joint Committee on Cancer)

Anti-AE1-AE3

anticuerpo biclonal formado por el cóctel de los clones AE-1 y AE-3

Anti-CK

anticuerpo frente a citoqueratinas

APC

gen de la poliposis adenomatosa coli, acrónimo derivado de su nombre en inglés (adenomatous polyposis coli)

ASCO

Asociación Americana de Oncología Clínica, acrónimo derivado de su nombre en inglés (American Association Clinical Oncology)

C(D)ETCs

células epiteliales tumorales diseminadas o circulantes, acrónimo derivado de su término en inglés (circulating (disseminated) epithelial tumor cells)

CEP17

sonda centromérica del cromosoma 17, acrónimo derivado de su nombre en inglés (chromosome 17 centromere probe)

CK

citoqueratina, acrónimo derivado de la palabra inglesa (cytokeratin)

CK-/CTCs

células tumorales circulantes citoqueratina negativas, acrónimo derivado de las palabras inglesas (cytokeratin negative/circulating tumor cells)

CK+

células citoqueratina positivas, acrónimo derivado de la palabra inglesa (cytokeratin positive)

CK+/CTCs

células tumorales circulantes citoqueratina positivas, acrónimo derivado de las palabras inglesas (cytokeratin positive/circulating tumor cells)

cm

centímetro

CSCs

células madre cancerosas, acrónimo derivado de su nombre en inglés (cancer stem cells)

Abreviaturas Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólido de origen epitelial.

CTCs

células tumorales circulantes, acrónimo derivado de su nombre en inglés (circulating tumor cells)

CTM

microémbolos tumorales circulantes, acrónimo derivado de su nombre en inglés (circulating tumor microemboli)

DTCs

células tumorales diseminadas, acrónimo derivado de su nombre en inglés (disseminated tumor cells)

ECO

Observatorio Europeo del Cáncer, acrónimo derivado de su nombre en inglés (European Cancer Observatory)

MRD

enfermedad mínima residual, acrónimo derivado de su nombre en inglés (minimal residual disease)

EMT

transición epitelio-mesénquima, acrónimo derivado de su nombre en inglés (epithelial mesenchymal transition)

EpCAM

molécula de adhesión de células epiteliales, acrónimo derivado de su nombre en inglés (epithelial cell adhesion molecule)

EPISPOT

sistema de detección de proteínas tumorales, acrónimo derivado de su nombre en inglés (epithelial immunospot)

ER

receptor de estrógenos, acrónimo derivado de su nombre en inglés (estrogen receptor)

ERBB2 (HER-2/neu)

gen del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano.

FAP

poliposis adenomatosa familiar, acrónimo derivado de su nombre en inglés (familial adenomatous polyposis)

FAST

tecnología de escaneo láser fibro-óptico de matriz, acrónimo derivado de su nombre en inglés (fiber-optic array scanning technology)

FC

citometría de flujo, acrónimo derivado de su nombre en inglés (flow cytometry)

FCS

suero fetal bovino, acrónimo derivado de su nombre en inglés (foetal calf serum)

Abreviaturas Utilidad pronóstica de la detección de células tumorales circulantes (CTCs) en pacientes con tumores sólidos.

FDA

Administración de Drogas y Alimentos, acrónimo derivado de su nombre en inglés (Food and Drug Administration)

FICTION

técnica de inmunofenotipación y análisis citogenético en interfase fluorescente como herramienta para la investigación de neoplasias, acrónimo derivado de su nombre en inglés (Fluorescence immunophenotyping and Interphase Cytogenetics as a Tool for Investigation of Neoplasms)

FISH

hibridación in situ fluorescente, acrónimo derivado de su nombre en inglés (fluorescence in situ hybridization)

FITC

isotiocianato de fluoresceína, acrónimo derivado de su nombre en inglés (fluorescein isothiocyanate)

GC

células granulocíticas, acrónimo derivado de su nombre en inglés (franulocytic cells)

HER2

receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano. Acrónimo derivado de su nombre en inglés (human epidermal growth factor receptor 2)

HER2+/CTCs

células tumorales circulantes que expresan HER2, acrónimo derivado de su nombre en inglés (HER2 positive/circulating tumor cells)

HNPCC

cáncer de colon hereditario no polipósico, acrónimo derivado de su nombre en inglés (hereditary nonpolyposis colorectal cancer)

ICC

técnica de inmunocitoquímica, acrónimo derivado de su nombre en inglés (immunocytochemistry)

IF

técnica de inmunofluorescencia

IgG

inmunoglobulina G

IHC

técnica de inmunohistoquímica, acrónimo derivado de su nombre en inglés (immunohistochemistry)

IN

número de identificación, acrónimo derivado de su nombre en inglés (identification number)

Abreviaturas Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólido de origen epitelial.

ITCs

células tumorales aisladas, acrónimo derivado de su nombre en inglés (isolated tumor cells)

KDa

kilo dalton

M0

pacientes que no presentan metástasis a distancia

M1

pacientes que presentan metástasis a distancia

mAbs

anticuerpos monoclonales, acrónimo derivado de su nombre en inglés (monoclonal antibodies)

MACS

sistema de enriquecimiento inmunomagnético por clasificación celular, acrónimo derivado de su nombre en inglés (magnetic-activated cell sorting)

MET

transición mesénquima-epitelio, acrónimo derivado de su nombre en inglés (mesenchymal epithelial transition)

mg

miligramo

min

minuto

MIS

inestabilidad de microsatélites, acrónimo derivado de su nombre en inglés (microsatellite instability)

ml

mililitro

MNC

células mononucleares, acrónimo derivado de su nombre en inglés (mononuclear cells)

N0

nódulos negativos para la detección de células tumorales

N1

nódulos positivos para la detección de células tumorales

NIH

Institutos Nacionales de la Salud, acrónimo derivado de su nombre en inglés (National Institutes of Health)

nm

nanómetro

OMS

Organización Mundial de la Salud

OS

supervivencia global, acrónimo derivado de su nombre en inglés (overall survival)

Abreviaturas Utilidad pronóstica de la detección de células tumorales circulantes (CTCs) en pacientes con tumores sólidos.

OSNA

amplificación de ácidos nucléicos en un solo paso, acrónimo derivado de su nombre en inglés (one-step nucleic acid amplification)

PB

sangre periférica, acrónimo derivado de su nombre en inglés (peripheral blood)

PBS

tampón fosfato-salino, acrónimo derivado de su nombre en inglés (phosphate buffered saline)

PCR

reacción en cadena de la polimerasa, acrónimo derivado de su nombre en inglés (polymerase chain reaction)

PCs

células progenitoras, acrónimo derivado de su nombre en inglés (progenitor cells)

PFS

supervivencia libre de progresión de la enfermedad o tiempo libre de enfermedad, acrónimo derivado de su nombre en inglés (progression free survival)

PgR

receptor de progesterona, acrónimo derivado de su nombre en inglés (progesterone receptor)

qRT-PCR

reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real, acrónimo derivado de su nombre en inglés (quantitative real time-polymerase chain reaction)

RT-PCR

retrotranscripción y reacción en cadena de la polimerasa, acrónimo derivado de su nombre en inglés (reverse transcription-PCR)

SCs

células madre, acrónimo derivado de su nombre en inglés (stem cells)

SD

desviación media, acrónimo derivado de su nombre en inglés (standard deviation)

SLN

ganglio linfático centinela, acrónimo derivado de su nombre en inglés (sentinel lymph node)

SSC

tampón citrato sódico salino, acrónimo derivado de su nombre en inglés (saline-sodium citrate)

TCs

células tumorales, acrónimo derivado de su nombre en inglés (tumor cells)

Abreviaturas Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólido de origen epitelial.

TNM

sistema de clasificación tumoral por tamaño del tumorafectación de nódulos linfáticos-metástasis a distancia

TOP2A

gen de la topoisomerasa II alfa humana

TOPO IIα

proteína topoisomerasa II alfa humana

ÍNDICE INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 1 I. CÁNCER DE MAMA Y COLON .................................................................................. 3 1. Epidemiología del cáncer ..................................................................................... 3 2. Detección, estadificación y clasificación del cáncer de mama y colon... 4 1.2.1. Detección del cáncer de mama y del cáncer colorrectal .................... 4 1.2.2. Estadificación y clasificación tumoral..................................................... 4

3. Cáncer de mama...................................................................................................... 5 1.3.1.1. Cáncer de mama no invasivo (in situ) .................................................. 8 1.3.1.1.1. Carcinoma ductal in situ .............................................................................8 1.3.1.1.2. Carcinoma lobular in situ ...........................................................................9 1.3.1.2. Carcinoma invasor ................................................................................ 9

1.3.2. Marcadores tumorales de cáncer de mama ........................................10 1.3.3. Tratamiento y progresión del cáncer de mama .................................11 1.3.3.1. Cirugía ...................................................................................................11 1.3.3.2. Tratamientos adyuvantes ............................................................................ 12 1.3.3.2.1. Radioterapia .............................................................................................12 1.3.3.2.2. Hormonoterapia .......................................................................................13 1.3.3.2.3. Quimioterapia ...........................................................................................13 1.3.3.3. Terapias con anticuerpos monoclonales (Terapia dirigida) ............14 1.3.3.3.1. Trastuzumab .............................................................................................14 1.3.3.3.2. Otros tratamientos dirigidos ....................................................................14

4. Cáncer colorrectal................................................................................................ 15 1.4.1.1. Cáncer de colon no invasivo (in situ) ................................................. 17 1.4.1.2. Carcinoma invasor .............................................................................. 17

1.4.2. Marcadores tumorales de cáncer colorrectal .................................... 18 1.4.3. Tratamiento y progresión del cáncer colorrectal ............................. 18 1.4.3.1. Cirugía ................................................................................................... 19 1.4.3.2. Tratamientos adyuvantes .................................................................... 19 1.4.3.2.1. Radioterapia ............................................................................................. 20 1.4.3.2.2. Quimioterapia .......................................................................................... 20 1.4.3.3. Terapias con anticuerpos monoclonales (Terapia dirigida) ........... 21 1.4.3.3.1. Bevacizumab ............................................................................................ 21 1.4.3.3.2. Cetuximab ................................................................................................ 21

II. CARCINOGÉNESIS. MODELOS

DE PROGRESIÓN TUMORAL Y FORMACIÓN DE

METÁSTASIS.............................................................................................................22

1. Carcinogénesis ...................................................................................................... 22 2.1.1. Modificaciones del citoesqueleto celular por la EMT ....................... 26 2.1.1.1. Cómo afecta la EMT al citoesqueleto celular ...................................... 28

2. Modelos de progresión tumoral y formación de metástasis. ................. 30 2.2.1. Modelo o hipótesis de la célula madre cancerosa ............................. 30 2.2.2. Modelo mecanicista .................................................................................... 32 2.2.3. Modelo de la “semilla y la tierra” ........................................................... 33 2.2.4. Modelo de fusión celular ........................................................................... 33 2.2.5. Modelo de selección y expansión clonal del cáncer .......................... 34 2.2.6. Modelo de heterogeneidad dinámica .................................................... 35 2.2.7. Modelo de la dominancia clonal ............................................................. 36 2.2.8. Modelo de evolución paralela del cáncer ............................................. 36 2.2.9. Teoría de especiación metastásica de poblaciones tumorales ..... 37

III.

CÉLULAS TUMORALES CIRCULANTES............................................................ 38

1. Definición de términos ........................................................................................38 2. Introducción ...........................................................................................................40 3. Técnicas de enriquecimiento, aislamiento y detección de CTCs y DTCs41 3.3.1. Técnicas de enriquecimiento y aislamiento de CTCs y DTCs ..........42 3.3.1.1. Sistemas basados en las características físicas de las células tumorales ...................................................................................................42 3.3.1.1.1. Centrifugaciones en gradientes de densidad ............................................42 3.3.1.1.2. Sistemas de captura celular por filtros o membranas porosas ...............45 3.3.1.2. Sistemas basados en las características biológicas de las células tumorales ................................................................................................................. 46 3.3.1.2.1. Captura por ensayos de invasividad .........................................................46 3.3.1.2.2. Sistemas de inmunorosetones: RosetteSep ...............................................47 3.3.1.2.3. Sistema basado en afinidad magnética con “sorting” celular ................48 3.3.1.2.4. Sistemas basados en ferrofluidos..............................................................50

3.3.2. Técnicas de detección de CTCs y DTCs ...................................................51 3.3.2.1. Técnicas histopatológicas convencionales .........................................51 3.3.2.2. Técnicas inmunológicas .......................................................................52 3.3.2.2.1. Técicas inmunohistoquímicas e inmunocitoquímicas .............................52 3.3.2.2.2. Técnicas de citometría de flujo .................................................................54 3.3.2.3. Técnicas moleculares ...........................................................................55

3.3.3. Otras técnicas de aislamiento y detección ...........................................61 3.3.3.1. Inmunospot epitelial ............................................................................61 3.3.3.2. Sistema FAST .........................................................................................62 3.3.3.3. Microchips .............................................................................................62 3.3.3.3.1. Microchip de aislamiento de células tumorales .......................................62 3.3.3.3.2. Microchip ultrasónico de captura de CTC ...............................................64

3.3.3.4. Nanopartículas ..................................................................................... 65 3.3.3.5. Sistema de filtración y eliminación de CTCs ....................................... 66

4. Tipos de muestra .................................................................................................. 67 3.4.1. Nódulos linfáticos ........................................................................................ 67 3.4.2. Médula ósea................................................................................................... 70 3.4.3. Sangre ............................................................................................................. 72 3.4.4. Otros tipos de muestra .............................................................................. 76 5. Características biológicas de las CTCs y las DTCs...................................... 77 3.5.1. Características morfológicas ................................................................... 77 3.5.2. Características fenotípicas ....................................................................... 78 3.5.3. Características genéticas .......................................................................... 89 3.5.4. Otras características .................................................................................. 92 3.5.4.1. Potencial proliferativo ......................................................................... 92

6. Relevancia clínica de la detección de DTCs y CTCs .................................... 95 3.6.1. Diseminación linfática ............................................................................... 95 3.6.2. Diseminación hematógena ....................................................................... 96 3.6.2.1. Detección de DTCs en médula ósea ..................................................... 96 3.6.2.1. Detección de CTCs en sangre periférica .............................................. 99

HIPÓTESIS DE TRABAJO ............................................................................... 105 OBJETIVOS........................................................................................................ 109

TRABAJO EXPERIMENTAL Y RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS ................................................................................................... 113 CAPÍTULO 1 ......................................................................................................... 115 Desarrollo de una técnica de aislamiento y cuantificación de células tumorales circulantes (CTCs) en sangre periférica Detección de CTCs en sangre periférica de pacientes diagnosticadas con cáncer de mama Análisis del valor pronóstico de este nuevo marcador

CAPÍTULO 2 ......................................................................................................... 125 Desarrollo de una nueva metodología que permite de forma individual realizar el análisis simultáneo del fenotipo y genotipo de las células tumorales circulantes

CAPÍTULO 3 ......................................................................................................... 137 Detección de células tumorales circulantes (CTCs) en sangre periférica de pacientes con cáncer de colon no metastásico Análisis del valor pronóstico de este nuevo marcador Verificación de la utilidad de la nueva metodología desarrollada y posibilidad de evaluar otros marcadores tumorales en las CTCs aisladas

CAPÍTULO 4 RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS ........................................... 153 Resultados del trabajo experimental del capítulo 1 ................................. 155 1.1. Mejora del rendimiento del enriquecimiento de células tumorales circulantes empleando una centrifugacion en doble gradiente de densidad ...................................................................................................155 1.2. Eficacia y especificidad del método .........................................................157 1.3. Correlación de células CK+ en sangre periférica con las características clinicopatológicas ....................................................................................158 1.4. Análisis pronóstico ...................................................................................161

Resultados del trabajo experimental del capítulo 2 .................................. 163 2.1. Eficiencia del método de inmunoselección de células tumorales (TCs) 163 2.2. Análisis FICTION (“Fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics as a tool for investigation of neoplasm”) de las TC seleccionadas ........................................................................................... 164

Resultados del trabajo experimental del capítulo 3 .................................. 168 3.1. Detección de células tumorales circulantes con expresión de citoqueratinas (CK+/CTCs) en pacientes con cáncer de colon ............. 168 3.2. Caracterización de las líneas celulares tumorales por FICTION y expresión de HER2 ................................................................................... 170 3.3. Análisis FICTION en las CK+/CTCs inmunoseleccionadas ..................... 174 3.4. Expresión de la proteína HER2 en las CTCs ............................................ 178 3.5. Immunohistoquímica e hibridación fluorescente in situ (FISH) del tumor primario del paciente IN28 ......................................................... 178

DISCUSIÓN GENERAL..................................................................................... 181 I. CARACTERÍSTICAS DEL ESTUDIO........................................................................ 183 1. Recogida de datos .............................................................................................. 183 2. Población de pacientes y tiempo de seguimiento .................................... 183 1.2.1. Tipo de población ...................................................................................... 183 1.2.2. Tamaño de la población de estudio y tiempo de seguimiento .... 190 3. Características de las técnicas empleadas ................................................ 192 1.3.1. Anticuerpos utilizados ............................................................................. 192 1.3.1.1. Anticuerpo de aislamiento de CTCs ................................................... 192 1.3.1.2. Anticuerpo de detección de CTCs ....................................................... 195

1.3.2. Técnica de aislamiento: doble gradiente de densidad y enriquecimiento inmunomagnético .................................................... 197 1.3.3. Técnicas de detección de CTCs............................................................... 203 4. Conservación de las muestras ....................................................................... 213

II. UTILIDAD

CLÍNICA DE LA DETECCIÓN DE

CTCS

EN SANGRE PERIFÉRICA DE

PACIENTES CON CÁNCER DE MAMA........................................................................ 216

1. Trabajos existentes sobre el tema ................................................................ 216 2. Relación de la presencia de CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama con los factores pronósticos clásicos ....................... 218 3. Impacto pronóstico de la presencia de CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama ........................................................................... 222

III. UTILIDAD

CLÍNICA DE LA DETECCIÓN DE

CTCS

EN SANGRE PERIFÉRICA DE

PACIENTES CON CÁNCER DE COLON ....................................................................... 225

1. Trabajos existentes sobre el tema ................................................................ 225 2. Relación de la presencia de CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer de colon con los factores pronósticos clásicos.......................... 227 3. Impacto pronóstico de la presencia de CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer de colon ............................................................................. 228

IV. VENTAJAS

DE LA TÉCNICA

FICTION

Y

CARACTERIZACIÓN, GENÉTICA Y FENOTÍPICA, DE LAS

UTILIDAD

CLÍNICA DE LA

CTCS EN SANGRE PERIFÉRICA

DE PACIENTES CON TUMORES SÓLIDOS EPITELIALES ............................................ 229

1. Ventajas de la técnica FICTION...................................................................... 229 2. Utilidad clínica en cáncer de mama............................................................. 230 3. Utilidad clínica en cáncer de colon............................................................... 233

CONCLUSIONES ............................................................................................... 239

BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. 243

ANEXOS ............................................................................................................. 305 ANEXO 1: CLASIFICACIÓN

DE LAS REVISTAS EN LAS QUE SE HAN PUBLICADO LOS

RESULTADOS DEL TRABAJO EXPERIMENTAL DE LA TESIS, OBTENIDO DEL

JCR

SCIENCE EDITION ................................................................................................. 307 ANEXO 2: APORTACIÓN

EXTRAORDINARIA RELEVANTE, PONENCIA EN CONGRESO

INTERNACIONAL ................................................................................................... 315

ANEXO 3: APORTACIONES,

REFERENTES AL TEMA DE LA TESIS, PRESENTADAS EN

CONGRESOS INTERNACIONALES QUE CONLLEVAN PUBLICACIÓN EN REVISTAS DE ALTO IMPACTO ..................................................................................................... 323

ANEXO 4: APORTACIÓN DE TRABAJOS PUBLICADOS NO REFERENTES AL TRABAJO DE LA TESIS

.............................................................................................................. 329

INTRODUCCIÓN

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

I.

CÁNCER DE MAMA Y COLON

1.

Epidemiología del cáncer Las estimaciones mundiales de incidencia y mortalidad para el

cáncer en 2008, según la Organización Mundial de la Salud (OMS), fueron unos 12,7 millones de nuevos casos diagnosticados y 7,6 millones de defunciones. El tipo de cáncer más diagnosticado en el mundo fue el de pulmón (1,61 millones; 12,7% de los casos de cáncer); seguido por el de mama (1,38 millones; 10,9%); y el colorrectal (1,23 millones; 9,7%). La causa

de

muerte

más

común

fue

por

cáncer

de

pulmón

(1,4 millones; 18,2%); seguida por cáncer de estómago (738.000 muertes; 9,7%); y cáncer de hígado (696.000 muertes; 9,2%) [Jemal y cols., 2001]. Al estudiar la incidencia y mortalidad por cáncer en España durante el año 2008, según el Observatorio Europeo del Cáncer (ECO), los tumores más frecuentes diagnosticados en hombres fueron: cáncer de próstata (25.561 casos; 22,7% de los casos de cáncer); cáncer de pulmón (20.347; 18,1%); y cáncer colorrectal (16.896; 15,0%), que suponen aproximadamente el 55,8% del total de los casos de cáncer en la población masculina. Los tumores con mayor número de defunciones en esta población fueron: cáncer de pulmón (17.841 casos; 30,2% de las defunciones por cáncer); cáncer colorrectal (8.427; 14,3%); y cáncer de próstata (6.150; 10,4%). En la población de mujeres, los tumores con mayor incidencia fueron: cáncer de mama (22.240 casos; más del 30%); seguido por el cáncer colorrectal (12.005 casos; 16,8%); y cáncer de pulmón (3.159; 4,4%), y los tumores de mayor mortalidad fueron: cáncer de mama y cáncer colorrectal con valores muy similares (6.076 y 6.067, respectivamente; 18,5%); y cáncer de pulmón (2.753; 8,4%) [ECO].

3

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

2.

Detección, estadificación y clasificación del cáncer

de mama y colon 1.2.1. Detección del cáncer de mama y del cáncer colorrectal La Sociedad Americana del Cáncer (American Cancer Society) recomienda seguir las guías de detección de cáncer de mama y colorrectal para conseguir así una detección temprana de estos tumores. Gracias a estos programas se ha reducido la mortalidad en ambos tipos de tumores [Andersson y cols., 1988; Day y Warren, 2000; Levin y cols., 2008; Hewitson y cols., 2007; Austoker y Hewitson, 2008].

1.2.2. Estadificación y clasificación tumoral Tras la detección del tumor primario se realizan varias pruebas: biopsias; marcadores tumorales en tejido y serológicos; rayos-X; tomografía y tomografía de emisión de positrones (PET); y ultrasonidos, para poder dar un estado clínico al tumor según el sistema TNM (tamaño del tumor-afectación de nódulos linfáticos-metástasis a distancia) del Comité Conjunto Americano del Cáncer (AJCC). Esta estadificación clínica puede variar tras el análisis patológico del tumor (estadificación patológica TNM), y según éste se clasifican a los pacientes en estadios tumorales.

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

3.

Cáncer de mama Según los datos epidemiológicos, el cáncer de mama es la

segunda enfermedad tumoral en términos de incidencia que afecta a la población mundial. Se puede decir que es una enfermedad que solo afecta a las mujeres, ya que los casos en hombres son raros y representan el 1% de todos los casos diagnosticados de cáncer de mama, con una mortalidad similar a la población de mujeres [Jemal y cols., 2011]. Debido a su alta incidencia, y su buena prognosis, el cáncer de mama es la enfermedad tumoral con mayor prevalencia a nivel mundial. El cáncer de mama tiene un origen genético, que puede deberse a mutaciones en células germinales (hereditario) o a mutaciones en células somáticas (esporádico) (Figura 1): 1. El cáncer de mama hereditario causa aproximadamente del 5% al 10% de todos los casos diagnosticados. Fue descrito como un enfermedad hereditaria autosómica dominante, asociada a la presencia de mutaciones germinales en los genes de susceptibilidad [Newman y cols., 1988; Claus y cols., 1991] BRCA1 y BRCA2 (síndrome del cáncer de mama-ovario hereditario) [Ford y cols., 1998]. Estudios realizados en familias y gemelos [Claus y cols., 1991; Lichtenstein y cols. 2000; Antoniou y cols., 2003], indican que existe un riesgo aumentado, de un aproximadamente un 27% [Lichtenstein y cols. 2000], de padecer un tumor de mama debido a factores hereditarios. Según el estudio de Balmain y cols. (2003) el cáncer de mama es un desorden poligenético, donde la predisposición hereditaria de desarrollar este tipo de tumor puede ser debida a los efectos

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derivados de la combinación de variantes genéticas en varios locus diferentes (posiblemente múltiples locus). Según este trabajo, sólo el 15% o el 20% de los casos de cáncer de mama familiares ocurren en familias con una alta predisposición a presentar una mutación en BRCA; por lo que el riesgo familiar restante a desarrollar el tumor invasivo (80%-85%) podría tener un origen genético o ambiental, aunque existe una predominancia de los factores genéticos [Antoniou y cols., 2001; Antoniou y cols., 2002; Balmain y cols., 2003]. El cáncer de mama hereditario presenta una heterogeneidad molecular, igual a la del cáncer de mama esporádico, donde las mutaciones en BCRA1/2 están correlacionadas, sobre todo, con el fenotipo del subtipo basal; y el debido a genes desconocidos (no asociado a BRCA), con el fenotipo del subtipo luminal A y ERBB2 [Melchor y Benítez, 2008]. 2. El cáncer de mama esporádico supone, aproximadamente, del 90% al 95% de los casos de cáncer de mama diagnosticados. Se divide en diferentes subtipos moleculares, lo más comunes son: subtipo basal, subtipo

ERBB2,

subtipo

luminal

A

y

subtipo

luminal

B

[Melchor y Benítez, 2008]. • El subtipo basal (15,6%-23,6%) es el menos diferenciado de todos y se caracteriza por la ausencia de la expresión de: ERBB2; ER (Receptor de estrógenos); y PgR (Receptor de progesterona), y presenta una alta expresión de genes típicos de células basales. • El subtipo ERBB2 (9,2%-20,8%) presenta sobreexpresión del gen ERBB2 y genes localizados en el amplicón 17q11, es negativo para la expresión de: ER; PgR; y marcadores basales.

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• Los

subtipos

luminales

(luminal

A:

36,0%-46,2%;

luminal B: 9,8%-16,5%) son positivos para marcadores luminales y ER (algunos tumores luminales B son ER-), y presentan expresión de ciertas proteínas, como TOPO IIα. En el cáncer esporádico, las alteraciones somáticas del tejido mamario pueden estar causadas por diversos factores (factores de riesgo), que al igual que en el caso del cáncer de mama hereditario pueden potenciarse entre sí. En los últimos años, diferentes estudios señalan que la heterogeneidad que encontramos en el cáncer de mama esporádico se debe a los diferentes tipos de eventos carcinogénicos que ocurren, y a la célula en la que ocurren [Melchor y Benítez, 2008]. Figura 1. Cáncer de mama esporádico y hereditario. Población de mujeres

89,1%

No desarrollan cáncer de mama

10,9% Según OMS, 2008.

Desarrollan cáncer de mama

1,38 millones

Cáncer 5%-10%

de

90%-95%

mama

Cáncer hereditario

≈80%-85%. Mutación en gen de baja penetrancia (FGFR2, TNRC9, MAP3KA, LSP1, TGFBR1, CASP8, ATM) [Easton y cols., 2007; Pasche, 2008]

≈15%-20%. Mutación en gen de alta

Cáncer esporádico Aumento del riesgo de cáncer de mama

Factores de riesgo

penetrancia [BRCA1, BRCA2 y otros genes asociados (CHEK2, TP53, PTEN, STK11)] [Antoniou y cols., 2001, 2002, 2003; Balmain y cols., 2003; Pasche, 2008]

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Algunos de los factores de riesgo que influyen para desarrollar un cáncer de mama son: edad del individuo, antecedentes familiares, edad de aparición de la menarquía, edad de aparición de la menopausia, edad en la que se tuvo el primer hijo, obesidad, nuliparidad, estilo de vida (consumición de tabaco y alcohol) [Rockhill, 2001] y estado nutricional [Sieri y cols., 2004; Fung y cols., 2005].

1.3.1.1. Cáncer de mama no invasivo (in situ) El carcinoma in situ de mama se define como una proliferación de células epiteliales malignas, sin evidencia de invasión a través de la membrana basal. Es considerado una lesión preneoplásica y su incidencia se ha incrementado debido a las campañas de cribado mamográfico que se realizan [Malmgren y cols., 2008]. Dependiendo del lugar de proliferación de las células epiteliales, anatomopatológicamente, los carcinomas in situ se clasifican como ductales o lobulares. Sin embargo, algunas lesiones in situ poseen características histológicas indeterminadas y no bien clasificadas [Fisher y cols., 1997], a día de hoy están apareciendo nuevos clases histológicas de carcinomas in situ que antes se consideraban dentro de estos dos tipos clásicos [O´Malley, 2010]. 1.3.1.1.1. Carcinoma ductal in situ El carcinoma ductal in situ (DCIS) se define como una proliferación de células epiteliales malignas, que crecen en el interior de los conductos sin

evidencia

de

invasión

a

través

de

la

membrana

basal

[Silverstein, 1998], y es considerado una lesión precursora del carcinoma invasivo o infiltrante. En el DCIS existe una prevalencia de mutaciones en BRCA1 y BRCA2 [Claus y cols., 2005] y otras características como la expresión del fenotipo angiogénico [Wülfing y cols., 2005].

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1.3.1.1.2. Carcinoma lobular in situ El carcinoma lobular in situ (LCIS) se define como una población de células monomorfas con poca cohesividad que expanden el lóbulo o el conducto lobular terminal, apareciendo en múltiples focos. La imagen final que aparece es a menudo la de un conducto terminal rodeado de un gran número de células aisladas, de tamaño uniforme pero con distinta forma [Foote y Stewart, 1941]. El LCIS es una lesión precursora del carcinoma invasivor [Simpson y cols., 2003; Gao y cols., 2010].

1.3.1.2. Carcinoma invasor [Kumar y cols., 2008] En todas las formas de cáncer de mama invasor (infiltrante) se produce la penetración de la membrana basal limitante, y la progresión de la enfermedad produce ciertas características morfológicas locales, como una tendencia a adherirse a los músculos pectorales o la fascia profunda de la pared torácica, con la consiguiente fijación de la lesión, así como adherencia a la piel que lo recubre, con retracción o formación de hoyuelos en la piel o en el pezón. La interacción entre las células tumorales y el estroma es fundamental para permitir el paso de carcinoma in situ a carcinoma invasivo. Entre los diferentes tipos de carcinoma de mama invasor encontramos: • Carcinoma ductal invasivo: del 70% al 80%; • Carcinoma lobulillar invasor: aproximadamente el 20%; • Carcinoma inflamatorio: del 1% al 5%; • Carcinomas raros: carcinoma medular (1%); carcinoma tubular (10% de los carcinomas invasores menores de 1 cm); carcinoma coloide.

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1.3.2. Marcadores tumorales de cáncer de mama Un marcador tumoral es una molécula; sustancia; o proceso, que está alterado cuantitativa o cualitativamente, en una condición precancerosa o cancerosa, detectable por una prueba. Esta alteración puede ser producida por el mismo tumor o por el tejido normal circundante, como respuesta a la lesión tumoral [Hayes y cols., 1996]. La guía de clínica práctica para uso de marcadores tumorales en la prevención, screening, tratamiento y supervivencia en cáncer de mama, publicada por la Asociación Americana de Oncología Clínica (ASCO) en 2007 [Harris y cols., 2007], recoge trece categorías de marcadores tumorales, de los cuales seis son nuevos. Marcadores aceptados en la guía del 2007: •

ERs y PgRs;



CA 15-3, CA 27.29 y CEA (antígeno carcinoembrionario);



HER2.

Marcadores aceptados que aparecen como nuevo tópico en la guía del 2007: •

uPA (activador del plasminógeno tipo uroquinasa) y PAI-1 (inhibidor tipo 1 del activador del plasminógeno);



Análisis multiparamétrico de la expresión génica (ensayo de Oncotype DX).

Otros marcadores que aparecen como nuevo tópico, pero de los cuales no existe todavía evidencia suficiente como para recomendarlos:

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Marcadores de proliferación evaluados por inmunohistoquímica;



Fragmentos de la Ciclina E;



Análisis proteómicos;

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.



Detección de micrometástasis en medula ósea;



Detección de células tumorales circulantes (CTCs) en sangre periférica.

1.3.3. Tratamiento y progresión del cáncer de mama Se considera que existe progresión de la enfermedad cuando tras aplicar un tratamiento el tumor aumenta de tamaño o aparece metástasis. El tratamiento más común en cáncer de mama es la cirugía, seguido por tratamientos adyuvantes.

1.3.3.1. Cirugía La cirugía del tumor consiste en la eliminación de éste y de los órganos afectados por el mismo, y puede ser conservativa o por mastectomía. El que se emplee una u otra depende del cirujano, ya que no presentan efecto sobre la supervivencia [Veronesi y cols., 2002]. Durante la intervención quirúrgica se suele realizar la biopsia del ganglio linfático centinela (SLN) o de varios ganglios axilares. Estos tejidos son evaluados por los patólogos y se clasifica el tumor definitivamente según: TNM patológico; estado de ER y PgRs; y estado del HER2. Si tras la biopsia del SLN o de los ganglios axilares se detectan células tumorales en estos, se realiza una cirugía posterior de eliminación de estos tejidos. En el año 2000 surge un método de detección de células tumorales en SLN que se realiza intraoperatoriamente, y se basa en la amplificación de ácidos nucléicos en un solo paso (OSNA) [Notomi y cols., 2000; Nagamine y cols., 2001]. Este ensayo permite la toma de decisión clínica,

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sobre la actuación quirúrgica a seguir, durante la operación [Tsujimoto y cols., 2007; Visser y cols., 2008; Schem y cols., 2009].

1.3.3.2.

Tratamientos

adyuvantes

[NIH

Consensus

Statement, 2000; FDA] Según las características del tumor primario (TNM, estado de receptores hormonales y del HER2) y del paciente (edad e historia clínica) los oncólogos decidirán el tratamiento adyuvante más adecuado, para lo cual se pueden ayudar de la evaluación de otros marcadores tumorales [Harris y cols., 2007]. Un adyuvante es una sustancia que contribuye a la acción de otra. Un tratamiento es adyuvante cuando acompaña a un tratamiento previo, considerado principal (cirugía). Si el tratamiento no principal va antes que el principal, se denomina neoadyuvante. En cáncer de mama se emplean tratamientos adyuvantes sistémicos, que incluyen quimioterapia y terapia hormonal; y un tratamiento adyuvante local, que es la radioterapia. 1.3.3.2.1. Radioterapia La radioterapia es la utilización de energía radiante para eliminar las células tumorales. La aplicación de esta suele realizarse tras la cirugía, aunque también se puede emplear de forma neoadyuvante para disminuir el tamaño del tumor y que éste se pueda extirpar quirúrgicamente. La radioterapia puede aplicarse externamente [haz externo (rayos X), haz de neutrones o haz de protones], o como terapia interna, braquiterapia, implantando un material radiactivo en el tejido. Existen evidencias clínicas del beneficio de aplicar radioterapia tras la cirugía [Vinh-Hung y Verschraegen, 2004; Early Breast Cancer Trialists’

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Collaborative Group, 2011; Veronesi y cols., 2001]. Un rasgo beneficioso de la radioterapia es el efecto de promoción que tiene sobre el sistema inmune, aumentando la infiltración de células inmunitarias y la activación de éstas [Shiao y Coussens, 2010]. 1.3.3.2.2. Hormonoterapia La hormonoterapia es una terapia dirigida y su aplicación dependerá de la expresión de ER y PgR en el tumor. La privación de estrógenos por parte del tumor se consigue aplicando: bloqueantes de los receptores (Tamoxifeno); supresores de la síntesis de estrógenos (Anastrozele); o eliminación de los ovarios (mujeres premenopáusicas). 1.3.3.2.3. Quimioterapia Los tratamientos de quimioterapia son más complejos y complicados, siempre seguidos de evaluaciones de respuesta al tratamiento y progresión de la enfermedad. La aplicación de estas terapias ha demostrado una mejora de la supervivencia a largo plazo y una disminución de la aparición de recurrencia de la enfermedad. Los regímenes más comunes son: 1. Aquellos que incluyen antraciclinas (doxorubicina y epirubicina), como: AC (doxorubicina y ciclofosfamida); CAF (ciclofosfamida, doxorubicina y 5-fluorouracilo); y CET (ciclofosfamida, epirubicina y 5-fluorouracilo). 2. Regímenes que incluyen taxanos (docetaxol o paclitaxol). Estos son los más empleados en casos con cáncer metastásico, y actualmente se está investigando su uso como tratamiento adyuvante en pacientes con cáncer de mama sin metástasis en nódulos linfáticos (N0).

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Generalmente los tratamientos con quimioterapia son aplicados a pacientes con metástasis en nódulos linfáticos (N1) o tumores primarios mayores de 1 cm.

1.3.3.3. Terapias con anticuerpos monoclonales (Terapia dirigida) [FDA] 1.3.3.3.1. Trastuzumab El trastuzumab (Herceptin) es un anticuerpo monoclonal antiHER2, inhibe la proliferación celular y es un potente mediador de la citotoxicidad mediada por células, que ha demostrado reducir la recurrencia de la enfermedad y aumentar la supervivencia de los pacientes. En 1998 la Administración de Drogas y Alimentos (FDA) aprobó, como primera línea de tratamiento, la administración de trastuzumab en combinación con paclitaxel en pacientes metastásicos cuyos tumores son HER2+. En 2006 la FDA aceptó que se podía expandir este tratamiento a pacientes con cáncer de mama en estadios tempranos HER2+. Otros tratamientos aprobados por la FDA anti-HER2 son: Lapatinib (también anti-HER1) y Pertuzumab. También hay tratamientos anti-HER1 (anti-EGFR) como Cetuximab, Gefitinib y Erlotinib. 1.3.3.3.2. Otros tratamientos dirigidos Actualmente se está estudiando la posibilidad de emplear otros tratamientos dirigidos como: Inhibidores del factor de crecimiento tipo insulina; Inhibidores de la polimerasa 1 poli-ADP-ribosa; Inhibidores de la vía de señalización PI3K/Akt/mTOR; y terapia epigenética (Inhibidores de la metilación del DNA e Inhibidores de la deacetilación de histonas).

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

4.

Cáncer colorrectal Según los datos epidemiológicos, el cáncer colorrectal es la

tercera enfermedad tumoral en incidencia que afecta a la población mundial. Es una enfermedad que afecta tanto a hombres como a mujeres, aunque existen diferencias en su incidencia y mortalidad según el género de la población, y entre países desarrollados y en vías de desarrollo [Jemal y cols., 2011]. El cáncer colorrectal puede tener un origen hereditario o ser esprádico (Figura 2): 1.

Los estudios realizados en familias y gemelos, permiten estimar que aproximadamente el 35% de los casos de cáncer colorrectal [Lichtenstein y cols., 2000] son una forma hereditaria de la enfermedad. Aproximadamente el 5% de estos casos hereditarios se asocia a mutaciones muy penetrantes cuyas manifestaciones clínicas están claramente caracterizadas. Los dos principales síndromes de cáncer de colon hereditario son: poliposis adenomatosa familiar (FAP), enfermedad autosómica dominante que se debe a mutaciones en el gen APC; y el cáncer de colon hereditario no polipósico (HNPCC), que es una predisposición autosómica dominante a desarrollar cáncer de colon debida a mutaciones en genes de reparación del DNA [Vasen, 2000; Kaz y Brentnall, 2006]. La etiología de los restantes casos de cáncer colorrectal hereditario no está definida completamente, y suelen estar causados por alteraciones en genes que son menos penetrantes,

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

pero más frecuentes que los síndromes bien definidos [Vasen, 2000; Kaz y Brentnall, 2006]. 2.

El cáncer colorrectal esporádico supone aproximadamente el 65% de los casos de cáncer colorrectal diagnosticados, y se produce por alteraciones en células somáticas, debido a diversos factores que están muy relacionados con el tipo de “vida” que lleva la persona afectada [Lichtenstein y cols., 2000].

Figura 2. Cáncer colorrectal esporádico y hereditario. Población mundial

Según OMS, 2008.

90,3%

No desarrollan cáncer colorrectal

9,7% Desarrollan cáncer colorrectal 1,23 millones

Cáncer 35%

65%

colorrectal

Cáncer esporádico

Cáncer hereditario ≈30%(≈85% CRC).Mutación en gen de baja penetrancia (CHEK2, MYH, HRAS1, CCND1, TGFBR1, GSTT1, ALDH2)

Aumento del riesgo de cáncer colorrectal

[de Jong y cols., 2002; Bian y cols., 2005; Alonso y cols., 2006]

Factores de riesgo

≈5%(≈14% CRC). Mutación en gen de alta penetrancia ≈1% de todos los CRC  FAP: 90% APC. ≈1%-5% HNPCC: 54% MIS [Lichtenstein y cols., 2000; Vasen, 2000; Katz y cols., 2006]

CRC = Cáncer colorrectal; FAP = Poliposis adenomatosa familiar; HNPCC = Cáncer de colon hereditario no polipósico; MIS = Inestabilidad de microsatélites.

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Los factores de riesgo para el cáncer colorrectal son, entre otros: antecedentes familiares, edad, obesidad [Harriss y cols., 2009], estilo de vida (consumición de tabaco, alcohol y actividad física) [Slattery, 2004; Phipps y cols., 2011] y estado nutricional [van Duijnhoven y cols., 2009].

1.4.1.1. Cáncer de colon no invasivo (in situ) [Kumar y cols., 2008] En la carcinogénesis colorrectal ocurre la secuencia pólipo - pólipo adenomatoso - adenoma temprano - adenoma tardío - carcinomametástasis. La forma precursora del adenoma tumoral es el pólipo preneoplásico. La mayoría de estos son pólipos hiperplásicos, pequeñas protuberancias de la mucosa (menores de 5 mm de diámetro), hemisféricas y lisas, que pueden aparecer de forma aislada pero es más común que sean múltiples. El pólipo adenomatoso o adenoma varía desde tumores pequeños a lesiones grandes, que surgen como resultado de la proliferación y displasia epitelial. El riesgo de malignidad de los pólipos adenomatosos se correlaciona con la localización, arquitectura histológica e intensidad de la displasia epitelial. Los pólipos adenomatosos se clasifican en: adenoma tubular (80%), adenoma velloso (1%); adenoma tubulovelloso (5%-10%); y adenoma serrado sésil.

1.4.1.2. Carcinoma invasor [Kumar y cols., 2008] Aunque todos los carcinomas colorrectales empiezan como lesiones in situ, evolucionan de acuerdo a patrones morfológicos diferentes. En el desarrollo del cáncer se van comprometiendo las diferentes capas del colon-recto, éste se inicia en el epitelio glandular

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

(estadio 0) invadiendo la submucosa (estadio I) y la muscularis propia (estadio II), llegando a comprometer los linfáticos de la capa submucosa y a alcanzar los ganglios linfáticos o los capilares (estadio III). La mayoría de los carcinomas colorrectales son adenocarcinomas (98%).

1.4.2. Marcadores tumorales de cáncer colorrectal En el 2006 se publicó una guía clínica de marcadores tumorales de cáncer gástrico que actualizaba y completaba la guía publicada en 1999 [Locker y cols., 2006]. Marcadores de cáncer colorrectal aceptados en la guía del 2006: •

CEA;



18q-/DCC.

Otros marcadores que aparecen como nuevo tópico, pero de los cuales no existe todavía evidencia suficiente como para recomendarlos: •

CA 19-9;



p53 o TP53;



K-ras;



Inestabilidad de microsatélites por hMSH2 o hMLH1;



Ploidia del DNA o análisis de proliferación por citometría de flujo;



Sintasa de timidina, dehidrogenasa dihidropirimidina y fosforilasa de timidina.

1.4.3. Tratamiento y progresión del cáncer colorrectal El tratamiento más común en cáncer colorrectal es la cirugía, acompañada en algunos casos por tratamientos adyuvantes.

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

1.4.3.1. Cirugía Aproximadamente el 90% de los pacientes con cáncer de colon son tratados con cirugía como primer tratamiento, con o sin tratamientos adyuvantes [Inomata y cols., 2009]. La cirugía del tumor consiste en la eliminación de éste y de los órganos afectados por el mismo, y puede realizarse colectomía,

de

forma

convencional

hemicolectomía

[cirugía

derecha,

abierta

(colostomía):

hemicolectomía

izquierda,

colectomía transversa, sigmoidectomía], la cual conlleva una mayor convalecencia, o a través de laparoscopia. El que se emplee una u otra depende básicamente del cirujano [Clinical Outcomes of Surgical Therapy Study Group, 2004; Inomata y cols., 2009]. Generalmente, en la misma cirugía de extirpación el tumor primario y si es necesario, se realiza la extirpación de los ganglios linfáticos. Estos tejidos son evaluados por los patólogos y se clasifica el tumor

definitivamente

según:

TNM

patológico

(características

macroscópicas); y clasificación con base al tipo histológico (Lauren-Jarvi [Lauren, 1965]; OMS): grado de diferenciación celular y localización.

1.4.3.2. Tratamientos adyuvantes [FDA] Según las características del tumor primario (TNM y clasificación histológica) y del paciente (edad e historia clínica) los oncólogos decidirán si se aplica un tratamiento adyuvante. Además, se pueden realizar análisis de otros marcadores tumorales para evaluar la terapia más beneficiosa para el paciente [Locker y cols., 2006]. Generalmente,

los

tratamientos

con

quimioterapia

son

administrados a pacientes N1 (III) o con metástasis a distancia (IV), pero

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

un 25% de los pacientes en estadio II sufren recurrencia. Esto hace pensar que el sistema de estadificación o las técnicas que se emplean para realizarlo no son las más adecuadas, además debido a que la presencia de metástasis en nódulos linfáticos es un predictor de la enfermedad [Cohen y cols., 1997] se ha empezado a aplicar la técnica del SLN en pacientes con cáncer de colon, para intentar identificar pacientes que podrían beneficiarse de una terapia adyuvante [Bilchik y Compton, 2007; Scabini, 2010]. A este respecto, hay que indicar que el ensayo OSNA está obteniendo buenos resultados en cáncer colorrectal [Yamamoto y cols., 2011]. 1.4.3.2.1. Radioterapia Al igual que en cáncer de mama, la radioterapia se puede emplear como radiación externa o como braquiterapia. Pero además, se puede emplear una terapia de radiación intraoperatoria. 1.4.3.2.2. Quimioterapia Todos los pacientes en estadio III reciben un tratamiento adyuvante con quimioterapia. Actualmente existe controversia si los pacientes en estadio II podrían beneficiarse de este tratamiento, y se recomienda cuando el tumor cumple ciertos parámetros como: alto grado de diferenciación, inestabilidad de microsatélites, afectación de órganos vecinos y márgenes del tumor afectados u obstrucción del colon. Desde 1990 la quimioterapia que se emplea es el 5-fluorouracilo con levamisole, en 2001 algunos regímenes comienzan a emplear la capecitabina de forma individual, y desde el 2004 también se emplea un régimen de oxaliplatino en combinación con 5-fluorouracilo y levamisole.

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Los tratamiento quimioterápicos que se administran como primera línea a pacientes metastásicos puede ser: leucovorin (más 5-fluorouracilo); irinotecan (más 5-fluorouracilo y levamisole); capecitabina; y oxaliplatino. En casos refractarios se emplea: irinotecan; y oxaliplatino (más 5-fluorouracilo y levamisole).

1.4.3.3. Terapias con anticuerpos monoclonales (Terapia dirigida) [FDA] 1.4.3.3.1. Bevacizumab El bevacizumab (Avastin) es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF, que reduce la vascularización de los tumores disminuyendo su crecimiento. Aunque actualmente la FDA ha iniciado el proceso de eliminación de este tratamiento en pacientes con cáncer de mama, su uso se sigue respetando en pacientes con cáncer colorrectal. En 2004 la FDA aprobó, como primera línea de tratamiento en pacientes metastásicos, la administración de bevacizumab junto con el régimen estándar de quimioterapia IFL (irinotecan + 5-fluorouracilo + levamisole). 1.4.3.3.2. Cetuximab El cetuximab (Erbitux) es una anticuerpo monoclonal anti-EGFR que inhibe o enlentece el crecimiento del tumor. En 2004 la FDA aprobó, como tratamiento tras una respuesta refractaria en pacientes metastásicos, la administración de cetuximab individualmente o junto con irinotecan, ya que éste demostró disminuir el crecimiento del tumor sobre todo al usarlo en combinación con la quimioterapia. El cetuximab y el panitumumab, anticuerpo monoclonal anti-EGFR, no deben emplearse en pacientes con cáncer colorrectal con mutaciones en K-ras.

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

II. CARCINOGÉNESIS. MODELOS

DE PROGRESIÓN TUMORAL Y

FORMACIÓN DE METÁSTASIS

1.

Carcinogénesis La carcinogénesis es la formación del cáncer. Este es un proceso

en el cuál células normales se transforman en células cancerígenas, y se caracteriza por ser una progresión de cambios celulares (genéticos, epigenéticos y fenotípicos) que reprograman a la célula para entrar en un proceso incontrolado de división. Según Harris (1991), la carcinogénesis es un proceso que consta de múltiples fases producidas por daños genéticos y epigenéticos, inducidos por un carcinógeno, en células susceptibles que adquieren una ventaja de crecimiento selectivo y sufren una expansión clonal como resultado de la activación de protooncogenes y/o inactivación de genes supresores de tumores (Figura 3). Los cambios necesarios para originar una célula cancerosa pueden ser llevados a cabo de forma diferente. Aunque todos los tumores malignos deben superar las mismas funciones regulatorias, para poder crecer y progresar, los genes involucrados y el orden en que lo hacen pueden variar.

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Figura 3. Carcinogénesis: proceso de múltiples fases que envuelve cambios genéticos y epigenéticos en protooncogenes, genes supresores tumorales y genes antimetastásicos [Harris, 1991]. Órganos superficiales

Iniciación

Progresión

Conversión

• Defectos en diferenciación terminal • Defectos en el control de crecimiento celular • Resistencia a citotoxicidad

QUÍMICOS Excreción RADIACIÓN

Promoción

Desactivación Cambios genéticos

VIRUS

Inhibición CÉLULA NORMAL

Selección clonal Cambios Expansión genéticos

CÉLULA INICIAL

LESIÓN PRENEOPLÁSICA

Cambios genéticos

TUMOR MALIGNO

Cambios genéticos

CÁNCER CLÍNICO

CÁNCER CLÍNICO

• Activación de protooncogenes • Inactivación de genes supresores del tumor • Inactivación de genes antimetastásicos

Cuando se producen múltiples mutaciones que afectan a múltiples genes, de forma progresiva, se generan unos atributos fenotípicos característicos del tumor que afectan a su agresividad y a su potencial maligno. Este fenómeno se denomina “progresión tumoral” y da lugar al fenotipo maligno del tumor, el cual viene determinado por [Hannahna y Weinberg, 2000]: •

Autosuficiencia en las señales del crecimiento;



Insensibilidad a las señales inhibidoras de crecimiento;



Evasión de la apoptosis;



Potencial replicativo ilimitado;

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Desarrollo

de

la

angiogénesis

sostenida

(fenotipo

angiogénico); •

Capacidad para invadir y metastatizar [fenotipo metastásico, transición epitelio-mesénquima (EMT) y mesénquimaepitelio (MET)].

Un punto de inflexión fundamental en la carcinogénesis es la formación de metástasis. La metástasis implica una asociación activa entre diferentes moléculas en el microambiente tumoral, como proteínas asociadas al tumor: uPA; metaloproteinasas; y fibrinógeno, o complejos de señalización: Akt1/PKB; y Wnt/β-catenina. La “cascada” metastásica conlleva: crecimiento de las células del tumor primario, escapar del tumor primario, EMT, motilidad y penetración en el estroma local, entrar en los vasos vasculares o linfáticos locales (intravasación), agregación con las plaquetas, interacción y adhesión con zonas endoteliales distante, extravasación, MET, recolonización (micrometástasis) y expansión (macrometástasis) (Figura 4). Todo esto se lleva acabo mientras las células metastásicas escapan del sistema inmune y sobreviven en estos ambientes adversos [Thompson y Newgreen, 2005; Miyazono, 2009; Gupta y Massagué, 2006; Paterlini-Brechot y Benali, 2007]. Figura 4. Pasos que llevan a la formación de metástasis. (1) El crecimiento celular supera los suministros de oxígeno y activan la angiogénesis. Se produce una regulación baja de la cadherina-E que conlleva una pérdida de la adhesión celular y una invasión de las células tumorales resistentes a la apoptosis. Las células tumorales invasivas, a través de la transición epitelio-mesénquima (EMT), pierden los antígenos epiteliales, adquieren antígenos mesenquimáticos y adquieren tendencias móviles (como los fibroblastos). (2) Tras la intravasación, entrada en los capilares sanguíneos y linfáticos, las células tumorales circulantes

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(CTCs) entran en apoptosis o empiezan a circular como células individuales. Las CTCs se encuentran en un estado no proliferante. (3A) Las CTCs se extravasan en distintos órganos. (4) Tras la extravasación, las CTCs se denominan células tumorales diseminadas (DTCs) y pueden permanecer en un estado de dormancia o entrar en un estado de proliferación, formando micrometástasis. (5) La proliferación desenfrenada de las CTCs originan metástasis, a través de la transición mesénquima-epitelio (MET) y angiogénesis. (3B-5) Los microémbolos tumorales circulantes (CTM) representan células tumorales que migran de forma colectiva. Estos CTM poseen un alto potencial metastásico, ya que son resistentes a la apoptosis y mantienen activas sus capacidades proliferativas. Los CTM no pueden extravasarse pero pueden quedar retenidos en los capilares y proliferar, dando lugar a la ruptura de las paredes de los capilares y formando metástasis [Paterlini-Brechot y Benali, 2007]. 1

Células tumorales circulantes (CTCs)

2

Tumor primario Angiogénesis Invasión

Intravasación

Microémbolo tumoral circulante (CTM)

CTCs apoptóticas 3A

Extravasación CTCs

Transición epiteliomesénquima (EMT)

3B

Proliferación intravascular (CTM)

Invasión 5

Transición mesénquimaepitelio (MET)

Metástasis 4

5

Metástasis

Proliferación tumoral Angiogénesis

Células tumorales diseminadas (DTCs) Micrometástasis Dormancia

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Para que las células tumorales puedan abandonar el tumor primario deben sufrir un cambio de fenotipo, desde célula epitelial (sésil) a célula mesenquimática (móvil), para esto deben atravesar la EMT. La EMT se caracteriza por ser un conjunto complejo y coordinado de cambios moleculares, que conducen a cambios en el comportamiento celular. La EMT que se produce durante el proceso metastásico se origina cuando las células tumorales epiteliales abandonan el tumor primario y migran a un nuevo órgano o tejido para formar un nuevo tumor. Para esto, inicialmente ocurre una rotura de las uniones de las células epiteliales (zonas occludens, uniones adherentes); la deslocalización de las proteínas de estas uniones; y una reorganización del citoesqueleto celular [Zeisberg y Neilson, 2009; Miyazono, 2009]. Con la EMT las células pierden la polaridad apico-basal, presentando una morfología en forma de huso, y expresan marcadores mesenquimales. Las señales que pueden inducir a las células tumorales a atravesar la EMT derivan en parte del estroma tumoral, y son señales como HGF, EGF, PDGF, y TGF-β [Massagué, 2008], que inducen la activación de factores de transcripción como Slug, ZEB1, Twist, Goosecoid y FOXC2 [Kalluri y Weinberg, 2009].

2.1.1. Modificaciones del citoesqueleto celular por la EMT Recuerdo del citoesqueleto celular de las células epiteliales [Kühnel, 2005]: El citoesqueleto es un entramado tridimensional dinámico de diferentes redes filamentosas que atraviesan la matriz citoplasmática. Existen tres redes bien definidas con características morfológicas diferentes: microfilamentos, filamentos intermedios (varían según el tipo celular) y microtúbulos. Cada una de estas redes está formada por proteínas específicas (Figura 5).

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Figura 5. A. Estructura del citoesqueleto. B. Microfotografía electrónica de los filamentos intermedios (10 nm de diámetro) en una célula epitelial [Urban y cols., 2010].

A

Microtúbulos

Microfilamentos de actina

Filamentos intermedios

• Microfilamentos (fibras de estrés): con un diámetro de 5 a 7 nm y compuestos por actina. Son los responsables de la forma celular (sostén estructural de las células), del movimiento de las células, y están unidos a proteínas transmembrana, cadherinas (E) e integrinas. • Filamentos intermedios (tonofilamentos): con un diámetro de 7 a 11 nm y compuestos por citoqueratinas, cuya función es mantener la integridad celular [Sun y cols., 1979]. Las citoqueratinas son una familia de 20 polipéptidos, que se dividen en dos grupos: tipo ácido o CKs tipo I, CK9-CK20, y tipo básico o CKs tipo II, CK1-CK8 [Moll, 1991; Moll y cols., 1982]. La formación de los filamentos suele requerir dos polipéptidos de CKs diferentes [Hatzfeld y Franke, 1985]. Estas proteínas son las responsables de la rigidez celular, forman haces que se orientan en la dirección de la fuerza tensil y se extienden desde el interior hacia las placas densas de los desmonsomas. • Microtúbulos: con un diámetro externo de 21 a 24 nm e interno de 14 a 16 nm, formados por filamentos de tubulina que originan una red extendida, no contráctil y sin ramificaciones. Son los responsables de la geometría celular, el transporte intracelular de organelas e intervienen en la composición de los cinocilios, centriolos, cinetosomas y los husos mitóticos.

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2.1.1.1. Cómo afecta la EMT al citoesqueleto celular Los elementos del citoesqueleto deben ser regulados de forma coordinada para que la célula pueda cumplir con funciones como: migración; adhesión; y división. La coordinación entre los elementos del citoesqueleto se consigue a través de vías de señalización en las que participan reguladores comunes, como la familia de proteínas Rho guanosina-5'-trifosfato (GTPasas), de ésta familia las proteínas mejor caracterizadas son: Rho, Rac y Cdc42 [Hall, 2009]. Debido a la EMT aparecen cambios en el citoesqueleto que conllevan la pérdida de polaridad y de adhesión celular, además de la pérdida de expresión de proteínas como la molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM) y CKs. Todo esto resulta en un incremento de la plasticidad celular, lo que es necesario para que las células pasen a ser móviles [Thiery, 2002]. Para que se produzca la pérdida de la polaridad y la ganancia de la movilidad celular, los filamentos de actina y los microtúbulos deben variar su organización en el citoesqueleto celular. El cambio de la polaridad celular puede ocurrir de forma espontánea, a través de una retroalimentación positiva y negativa que envuelve a las proteínas Rho y Rac [Hall, 2009]. La migración celular se debe a la polimerización de los filamentos de actina en la zona anterior de la célula, lo cual genera la contracción de los filamentos de actina:miosina en la zona posterior, seguido del reclutamiento de los microtúbulos [Waterman-Storer y Salmon, 1997]. Esto conlleva la activación de Rac, que se localiza en la parte anterior, y la de Rho, que se localiza en la parte posterior de la célula. La movilidad celular, o retracción del cuerpo de la célula, requiere

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de la transmisión de la fuerza que generan los movimientos de los filamentos de actina del interior celular a la matriz extracelular, esto se consigue regulando la formación de nuevos sitios de adhesión a la matriz y destruyendo las antiguas adhesiones que existían entre la célula y el sustrato [Wittmann y Waterman-Storer, 2001]. Aparece así una retroalimentación positiva entre la reorganización del citoesqueleto y destrucción-formación de uniones adherentes, donde la formación de nuevas adhesiones, más estables, y la destrucción de las antiguas estimula la reorganización del citoesqueleto celular; y la polimerización de la actina, y la reorganización del citoesqueleto celular, estimula la formación de nuevas adhesiones celulares y la destrucción de las antiguas [Parsons y cols., 2010]. Para que se produzca la migración celular, además de la polimerización de los filamentos de actina, debe ocurrir la reorientación del centrosoma hacia la zona de migración celular, a través de la reorganización de los microtúbulos por Cdc42 [Hall, 2009]. Durante la EMT ocurre una variación en la expresión de CKs, que algunas veces conlleva la pérdida o disminución de la expresión de éstas, lo que resulta en una mayor plasticidad celular [Schaller y cols., 1996]; y aparece la expresión de vimentina [Willipinski-Stapelfeldt y cols., 2005], lo que origina una mayor agresividad tumoral. Por ejemplo, en el tejido normal mamario las CKs más expresadas son las CK8, CK18 y CK19, estás son también las CKs más expresadas en los tumores de mama [Moll y cols., 1982; Moll, 1991] y son utilizadas para identificar tanto tumores primarios como metástasis. No obstante, varios estudios han encontrado una asociación entre la pérdida de la expresión de estas CKs y la aparición de la expresión de vimentina con factores de riesgo tumoral

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(grado tumoral, índice mitótico tumoral o ausencia de ER o PgR), lo que indica un peor pronóstico de la enfermedad; sobre todo la pérdida de la expresión de CK8 que parece estar correlacionada con la progresión de la enfermedad, tumores más agresivos y una menor supervivencia [Woelfle y cols., 2004; Willipinski-Stapelfeldt y cols., 2005]. Otro ejemplo de la pérdida o disminución de la expresión de CKs durante la EMT, se puede observar en los resultados obtenidos por varios grupos de investigación que analizan la detección de CTCs en sangre periférica o DTCs en médula ósea, donde se ha demostrado que estas células expresan diferentes patrones de CKs [Effenberger y cols., 2011], pudiendo ser incluso negativas para algunas de ellas [Pantel y cols., 1994; Fehm y cols., 2002; Mikolajczyk y cols., 2011], al igual que ocurre con la EpCAM [Willipinski-Stapelfeldt y cols., 2005; Rao y cols., 2005; Paterlini-Brechot y Benali, 2007; Antolovic y cols., 2010].

2.

Modelos de progresión tumoral y formación de

metástasis. 2.2.1. Modelo o hipótesis de la célula madre cancerosa En 1855, Rudolf Virchow estableció que “omnis cellula e cellula ejusdem generis” (toda célula proviene de otra célula preexistente), con este enfoque se inicia la patología celular y propone que todas las enfermedades implican cambios en células normales preexistentes. En 1877 Cohnheim propone la “teoría embrionaria” del cáncer, la cual postula que los tumores surgen de células embrionarias que existen en los tejidos y no han alcanzado su madurez, estas serían células latentes que conservan su capacidad de proliferación. A partir de esta teoría se desarrolló la “hipótesis de la célula madre cancerosa (CSC)”, la cual

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establece que el cáncer se desarrolla a partir de un conjunto de células malignas que poseen características de células madre, como el potencial de crecimiento indefinido [Li y cols., 2007; Goldthwaite, 2009]. Surgen así las CSCs, que expresan características tanto de células tumorales como de células madre (SC), poseen la propiedad de autorenovación, división asimétrica, resistencia a la apoptosis, crecimiento independiente, tumorigenicidad y potencial metastásico [Talmadge y Fidler, 2010]. La hipótesis de las CSCs sugiere que los tumores poseen una población de CSCs que se dividen asimétricamente y originan células progenitoras (PCs) de una forma rápida, las cuales con el tiempo se diferencian y agotan su potencial proliferativo. Las CSCs remanentes mantendrían su fenotipo original y su competencia proliferativa [Talmadge y Fidler, 2010]. Varios estudios, que han empleando modelos murinos de trasplantación in vivo, han demostrado la existencia de las CSCs en varios tipos de tumores, y su potencial de autorenovación, originando nuevos tumores con diferentes poblaciones celulares (Figura 6).

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Figura 6. Identificación de células madre cancerosas (CSCs) [Galleano, 2005]. Ensayos de trasplantación in vivo

Cáncer de cerebro CD133

Cáncer de cabeza y cuello

CD44

Inyección en cerebro

+

Singh y cols., 2003 Inyección subcutánea

+

Cáncer de mama

Prince y cols., 2007

Cáncer de colon +

CD44 /CD24

-/bajo

Inyección en glándula mamaria Al-Hajj y cols., 2003

CD133

Leucemia mieloide aguda (AML)

+

Inyección subcutánea bajo cápsula renal

+

CD34 /CD38

-

O´Brien y cols., 2007 Ricci-Vitani y cols., 2007

Inyección intravenosa

Lapidot y cols., 1994 Bonnet y Dick, 1997

2.2.2. Modelo mecanicista En 1858 Rudolf Virchow propone que la diseminación metastásica del tumor es determinada por factores mecánicos (detención de émbolos de células tumorales en el sistema vascular). En 1928 James Ewing emite la teoría mecanicista de la implantación, según la cual la diseminación metastásica ocurre por factores mecánicos determinados por la estructura anatómica del sistema linfático y hematógeno. Según esta hipótesis las células tumorales saldrían del tumor primario y circularían como un trombo neoplásico, la metástasis se formarían cuando el trombo impacta y provoca un pequeño infarto, en esa zona se iniciaría el crecimiento del nuevo tumor.

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

2.2.3. Modelo de la “semilla y la tierra” En 1889 Stephen Paget estableció el modelo de la “Semilla y Tierra Fértil”, donde propone que sólo ciertas células tumorales (semillas) pueden colonizar selectivamente órganos distantes (tierra fértil), los cuales deben poseer un microambiente apropiado para el crecimiento del nuevo tumor. Presenta así a las células tumorales que causan las metástasis, como células con un potencial de invasión (influencia seminal) y no solamente como un trombo neoplásico que queda atrapado en la red capilar; y al órgano secundario como un órgano predispuesto para la invasión. Estudios posteriores han demostrado la existencia de numerosos factores que determinan una interacción específica entre las células tumorales y el microambiente del órgano diana, y favorecen la formación

de

metástasis

en

sitios

específicos

del

cuerpo

[Fokas y cols., 2007].

2.2.4. Modelo de fusión celular En 1911 Otto Aichel postula que la fusión de leucocitos con células tumorales puede dar lugar a híbridos y el producto final serían, lo que hemos llegado a definir como células malignas [Pawelek, 2005]. Esta idea ha sido apoyada por los resultados de varias investigaciones [Mortensen y cols., 2004; Vignery, 2005]. Cuando dos células se fusionan, los rasgos funcionales y genéticos de ambas se pueden apreciar en la célula hija, ya sea porque aparecen los dos núcleos parentales sin fusionarse realmente (por ejemplo, heterocarionte) o porque aparece un núcleo fusionado que expresa los genes de ambas células parentales (por ejemplo, sincarionte) [Friedl, 2005]. Actualmente, los mecanismos de fusión celular no están

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

claros, aunque Pawelek (2005) menciona que esta fusión podría aparecer debido a una fagocitosis aberrante de células tumorales apoptóticas por macrófagos. Según este investigador, la fusión de células tumorales con células mieloides podría explicar la EMT que ocurre durante la progresión tumoral.

2.2.5. Modelo de selección y expansión clonal del cáncer En 1976 Nowell propone la hipótesis de un modelo de cáncer, tanto de carcinogénesis como de progresión tumoral, que se basa en una selección y expansión clonal (modelo de progresión o modelo estocástico). Este modelo sugiere que la mayor parte de las neoplasias surgen de una sola célula original, y es la variabilidad genética adquirida por el clon neoplásico lo que permite que se seleccionen subpoblaciones celulares mutadas más agresivas que resultaran ser las responsables de la progresión tumoral y, por lo tanto, de la formación de las metástasis (clon más avanzado). La adquisición de la inestabilidad genética y el proceso de selección asociado que conlleva, el cual puede ser reconocido citogenéticamente, dan lugar a tumores avanzados que son biológica y cariotípicamente muy individuales. Este modelo estocástico es explicado con detalle en el trabajo de Fearon y Vogelstein (1990) sobre la carcinogénesis del cáncer colorrectal (Figura 7). Este modelo sostiene que la mayoría de las células tumorales poseen un potencial metastásico bajo, pero que algunas células, menos de una entre diez millones de células tumorales, adquieren esta capacidad

metastásica

[Poste y Fidler, 1980].

34

a

través

de

mutaciones

somáticas

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Figura 7. Modelo de la carcinogénesis del cáncer colorrectal (adaptada de Fearon y Vogelstein, 1990). Para la iniciación del tumor son precisas mutaciones en APC, β-catenina o genes axiales. La progresión tumoral, hacia la malignidad del tumor subsecuente, se debe a la inestabilidad genética y las mutaciones secuenciales en los genes K-ras, Smad4, TP53, como en otros genes desconocidos [Pinto y Clevers, 2005]. Segundo evento: Mutación somática Primer evento: de APC Mutación K-ras Inestabilidad Somática de APC

Smad4

p53

Otras alteraciones

genómica Epitelio normal

Criptas aberrantes

Primer evento: Mutación de APC en línea germinal

Adenoma temprano

Adenoma intermedio

Adenoma tardío

Carcinoma

Metástasis

β-Catenina Axin

Una consecuencia del modelo de selección y expansión clonal es que en los tumores primarios pueden existir múltiples subpoblaciones clonales que son capaces de formar focos metastásicos, lo que resulta en metástasis fenotípicamente diferentes. Además, debido a la inestabilidad genética, una metástasis clonal puede volverse rápidamente heterogénea [Talmadge, 2007; Talmadge y Fidler, 2010].

2.2.6. Modelo de heterogeneidad dinámica En 1982 Harris y cols. proponían un modelo de heterogeneidad dinámica para la formación de las metástasis. Este modelo sugiere que la frecuencia de las variantes metastásicas que aparecen en el tumor determinan el potencial metastásico de éste, y se explicaría como un proceso estocástico que depende del tamaño del tumor, donde las

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

variantes metastásicas, que son inestables, estarían en un equilibrio dinámico de aparición y desaparición entre ellas mismas y con las células del tumor sin capacidad metastásica. Este modelo incorpora el concepto de fenotipo metastásico transitorio y de EMT [Talmadge, 2007].

2.2.7. Modelo de la dominancia clonal En 1988 Kerbel y cols. demostraron la existencia de una dominancia clonal, este modelo sugiere que cuando un subclon metastásico surge en el tumor primario, las células de este subclon deben haber superado y dominar a la masa de células tumorales restantes. Esto daría como resultado similitudes fenotípicas entre el tumor primario y los focos metastásicos [Talmadge, 2007].

2.2.8. Modelo de evolución paralela del cáncer En 2003 Schmidt-Kittler y cols. presentaron evidencias que sugerían que la selección y expansión clonal no es la mejor hipótesis para explicar el proceso metastásico, sino que éste se explica, más precisamente, por un modelo de evolución paralela. En este modelo ocurriría una diseminación de células tumorales temprana durante el desarrollo tumoral, lo que supone una propagación de células tumorales en un estadio genómico menos avanzado de lo que se pensaba, portando estas células aberraciones genéticas diferentes al tumor primario, y una evolución independiente entre las células metastásicas y las células tumorales del tumor primario. Otros estudios [Ramaswamy y cols., 2003; Eide y cols., 2010].

36

apoyan este modelo

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

2.2.9. Teoría de especiación metastásica de poblaciones tumorales La “teoría de especiación metastásica de poblaciones tumorales”, propuesta por Massagué [Massagué, 2009], se puede entender como una combinación entre el modelo de la CSCs y el modelo de evolución paralela del cáncer. Según ésta, los tumores son “poblaciones celulares genéticamente diversificadas que habitan el ecosistema reactivo de nuestro organismo, donde están sometidas a presiones ambientales que generan la selección del más fuerte, de tal forma que en cada estadio del desarrollo tumoral nuevas minorías celulares quedan seleccionadas, convirtiéndose en la estirpe dominante. Si dicha estirpe, además, retiene la capacidad propagadora del tumor actuando como célula madre de cáncer, el tumor se propaga. Las CTCs van a ser capaces de infiltrar un órgano determinado solamente si poseen las funciones necesarias para atravesar las paredes de los capilares de este órgano [Minn y cols., 2005a; Minn y cols., 2005b; Gupta y cols., 2005; Minn y cols., 2007; Padua y cols., 2008; Nguyen y cols., 2009; Bos y cols., 2009]. De las células individuales que pasan esta selección, solamente van a ser viables aquellas que estén equipadas con funciones para sobrevivir en el nuevo entorno [Minn y cols., 2005a; Gupta y cols., 2005] y un pequeño número de estas tendrá la habilidad de reiniciar el crecimiento tumoral (células madre tumorales o células de propagación tumoral) [Gupta y cols., 2005]”. Además, las CTCs pueden colonizar su órgano de origen, en un proceso denominado “autosiembra tumoral” (“tumor self-seending”), que podría ser la causa de la recurrencia local tras la extirpación del tumor primario. [Kim y cols., 2009].

37

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III.

CÉLULAS TUMORALES CIRCULANTES

1.

Definición de términos Enfermedad mínima residual (MRD de sus siglas en inglés

“Minimal residual disease”): El término enfermedad mínima residual hace referencia a la persistencia de células tumorales tras el tratamiento. Estas células tumorales remanentes, son el origen de las futuras metástasis [Pantel y Brakenhoff, 2004] y su detección no es posible por técnicas convencionales. compartimientos

La

MRD

puede

corporales,

ser

detectada

incluyendo

en

diferentes

ganglios

linfáticos

[Weitz y cols., 1999; Sakorafas y cols., 2004], médula ósea [Müller y cols., 1996; Braun y cols., 2000], y sangre periférica [Gaforio y cols., 2003; Cristofanilli y cols., 2004]. La detección de la MRD ha sido posible en diferentes tipos de tumores sólidos epiteliales, como son: cáncer de mama [Gaforio y cols., 2003; Braun y cols., 2000]; cáncer de colon [Cohen y cols., 2008; Vlems y cols., 2003]; y cáncer de próstata [Moreno y cols., 2001; Swennenhuis y cols., 2009]. Células

tumorales

aisladas

(ITCs),

micrometástasis

y

macrometástasis: Estos términos hacen referencia a las células tumorales que se encuentran en los nódulos linfáticos, y su detección repercute en la valoración del TNM del tumor. Las ITCs son células tumorales individuales o pequeños cluster de éstas, cuyo tamaño no es superior a 0,2 mm. Las ITCs no muestran características malignas: no tienen actividad proliferativa ni presentan reacción del estroma. Las micrometástasis son cluster de células tumorales cuyo tamaño varía de los 0,2 mm a los 2 mm, y muestran características malignas. Las macrometástasis son cluster de células tumorales, o depósitos de éstas,

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

cuyo tamaño es superior a los 2 mm, y muestran características malignas. La detección de las ITCs, micrometástasis y macrometástasis, puede ser por hematoxilina y eosina, inmunohistoquímica o técnicas moleculares [Greene y cols., 2002]. Células tumorales diseminadas (DTCs): Este término se referiere a las células tumorales que se localizan en otros órganos, sobre todo en médula ósea, algunas veces también denomidas micrometástasis o ITCs [Naume y cols., 2004a; Wiedswang y cols., 2004]. Este término se ha empleado algunas veces para las células tumorales que se detectan en sangre periférica [Naume y cols., 2004b]. Células tumorales circulantes (CTCs): Término con el que se refiere a las células tumorales que se han desprendido del tumor primario y circulan por el torrente sanguíneo. Estas células tumorales tienen potencial maligno, el cual ha sido demostrado por la capacidad de formación de metástasis in vivo que poseen [Pretlow y cols., 2000] y las anomalías

cromosómicas

que

portan

[Fehm

y

cols.,

2002;

Meng y cols., 2004a; Swennenhuis y cols., 2009]. Existen otros términos que también se usan para referirse a las CTCs, por ejemplo: células citoqueratín positivas (células CK+) [Gaforio y cols., 2003]; o células epiteliales

tumorales

diseminadas

o

circulantes

(C(D)ETCs)

[Martin y cols., 1998; Pachmann y cols., 2008; Pachmann y cols., 2011]. Microémbolos tumorales circulantes (CTM): Este término hace referencia a las células tumorales que migran de forma colectiva por la sangre periférica o por los vasos linfáticos. Poseen un alto potencial metastásico, ya que mantienen activas sus capacidades proliferativas [Paterlini-Brechot y Benali, 2007; Cho y cols., 2012].

39

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

2.

Introducción En 1869 Thomas Ashworth aisló y detectó células tumorales en

sangre periférica de un paciente con cáncer de próstata metastásico. Tras una comparación minuciosa de la morfología de estas CTCs con las del tumor primario, Ashworth postuló que “las células aisladas en la sangre periférica del paciente eran idénticas a las del tumor primario, y este hecho podría explicar el origen de los múltiples tumores que se originan en una misma persona”. El segundo trabajo que habla de la detección de células tumorales en sangre periférica de pacientes con cáncer, fue el de Engell en 1955. En 1959 este autor analizó la presencia de células tumorales en sangre periférica de 125 pacientes con cáncer gastrointestinal [Engell, 1959] y detectó que el 61% de los casos presentaban células tumorales en las muestras sanguíneas, y esta presencia estaba asociada con el grado de diferenciación tumoral. Debido a que el 51% de los pacientes que sobrevivieron de 5 a 9 años, tras la resección del tumor, presentaban células tumorales, Engell sugirió que “la diseminación de estas células hacia el torrente sanguíneo debía haber ocurrido antes o durante la cirugía”. Actualmente sabemos que el factor más importante que afecta a los pacientes con tumores sólidos invasivos, es la propagación tanto regional (nódulos linfáticos regionales) como sistémica del tumor. En muchos pacientes la formación de metástasis ya se ha producido en el momento del diagnóstico del tumor primario, aunque clínicamente no existan evidencias de éstas [Talmadge y Fidler, 2010]. Por ejemplo, aproximadamente entre el 25% y el 30% de los pacientes N0 con cáncer

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

de mama presentan recurrencia de la enfermedad tras la extirpación del tumor primario [Janni y cols., 2005a; Riethdorf y cols., 2008]; en el caso de cáncer colorrectal, aproximadamente el 50% de los pacientes que son sometidos a cirugía curativa mueren por enfermedad metastásica a los 5 años, incluso los pacientes N0 presentan una recurrencia de aproximadamente el 30% [Riethdorf y cols., 2008]. Esto indica que debe existir una diseminación hematógena oculta [Janni y cols., 2005b; Riethdorf y cols., 2008], y que ésta es indetectable por los métodos diagnósticos

tradicionales

empleados

[Hosch

y

cols.,

2001;

Hawes y cols., 2001].

3.

Técnicas

de

enriquecimiento,

aislamiento

y

detección de CTCs y DTCs El primer paso en la detección eficaz de las CTCs y DTCs es distinguir entre células tumorales y normales. En el caso de muestras de tejido, como médula ósea y nódulos linfáticos, las células tumorales pueden ser identificadas por técnicas histológicas, mientras que la identificación de las células tumorales en la circulación hematógena representa un desafío más complejo. Todas las técnicas de detección de CTCs y DTCs se enfrentan a dos problemas: 1. la escasez de células tumorales presentes en la muestra, sobre todo en el caso de las muestras sanguíneas; 2. la necesidad de emplear un marcador lo más específico posible que diferencie células tumorales de células normales.

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3.3.1. Técnicas de enriquecimiento y aislamiento de CTCs y DTCs Los sistemas de enriquecimiento y aislamiento de células tumorales son necesarios en el análisis de muestras sanguíneas, y en el análisis de muestras de tejido que no se haga por cortes o secciones del mismo. Se puede decir que existen dos sistemas básicos de enriquecimiento y aislamiento, que no son excluyentes entre sí, y están basados en las características físicas y biológicas de las CTCs y DTCs.

3.3.1.1. Sistemas basados en las características físicas de las células tumorales 3.3.1.1.1. Centrifugaciones en gradientes de densidad Los métodos de centrifugación en gradiente de densidad permiten la separación de las células de la muestra sanguínea o del aspirado medular. Las interfases celulares que aparecen en la muestra tras la centrifugación, son utilizadas para un posterior enriquecimiento de la muestra o para la detección por métodos inmunológicos o moleculares de las CTCs y DTCs. Los métodos de centrifugación en gradiente de densidad más utilizados son: •

Centrifugación en gradiente de densidad simple: Emplea un solo ficoll para el aislamiento de las células nucleadas. Tras añadir la muestra sanguínea al ficoll y realizar la centrifugación, las células sanguíneas quedan distribuidas de la siguiente forma: plaquetas; eritrocitos y polimorfos nucleares, que quedan separados en el pellet; y las células mononucleares (MNC), que quedan en la

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interfase que se crea entre el ficoll y el plasma (plasma/ficoll). Las CTCs se aíslan en esta interfase de células nucleadas. Para el aislamiento de las DTCs en aisparados de médula ósea, también se emplea un solo medio de separación y las DTCs aparecen en la interfase MNC [Naume y cols., 2001; Wiedswang y cols., 2003; Benoy y cols., 2004; Pantel y Barkenhoff, 2004]. Centrifugación

en

gradiente

de

densidad

OncoQuick

(Greiner Bio-one): Este sistema se emplea para el aislamiento de CTCs en muestras sanguíneas. El kit viene equipado con tubos de centrifugación que poseen una membrana porosa sobre un medio de separación. Tras añadir la muestra sanguínea y realizar la centrifugación, las células sanguíneas quedan distribuidas de la siguiente forma: eritrocitos, en el pellet; leucocitos, encima del pellet; plaquetas, retenidas en la membrana. Las CTCs, y algunas plaquetas, aparecen en la interfase plasma/medio de separación (Figura 8). Este sistema permite una mayor recuperación de CTCs que el sistema de centrifugación en gradiente de densidad simple [Rosenberg y cols., 2002]. Actualmente existe una variación de este sistema que es la centrifugación en gradiente de densidad OncoQuick plus, el cual es muy similar al sistema previo pero permite una mayor recuperación de CTCs y reproducibilidad de los ensayos [Königsberg y cols., 2010]. •

Centrifugación en doble gradiente de densidad discontinuo: este sistema fue desarrollado por English y Andersen (1974), para permitir la separación simultánea de las MNC y las células granulocíticas (GC) de la muestra sanguínea. Gaforio y cols. (2003) emplearon este sistema de enriquecimiento y comprobaron que

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permitía una mayor recuperación de CTCs que el sistema de gradiente de densidad simple. Este sistema emplea dos medios Ficoll-Histopaque con densidades diferentes, 1,077 y 1,119. Tras añadir la muestra sanguínea al doble gradiente de densidad y realizar la centrifugación, las células sanguíneas quedan distribuidas de la siguiente forma: eritrocitos, separados en el pellet; granulocitos, en la interfase ficoll-1,077/ficoll-1,119; y células mononucleares y plaquetas, en la interfase plasma/ficoll-1,077. Las CTCs se aíslan en ambas interfases de células nucleares (Figura 8). Figura 8. A. Esquema del sistema de centrifugación en doble gradiente de densidad. El doble gradiente de densidad se forma al extender un volumen de Ficoll-Histopaque 1077 sobre un volumen igual de Ficoll-Histopaque 1119. La sangre se extiende cuidadosamente sobre el medio superior (Ficoll-Histopaque 1077) y se centrifuga la muestra a 18-26 ºC durante 30 min a 700Xg. Tras este proceso, las células sanguíneas quedan divididas entre las interfases celulares y el pellet: las células de las series granulocíticas se encuentran entre el FicollHistopaque 1077 y el 1119, mientras que los linfocitos, otras células mononucleares y las plaquetas se encuentran en la zona entre el plasma y el Ficoll-Histopaque 1077. Las células tumorales circulantes (CTCs) aparecen en las interfases

celulares

plasma/Ficoll-Histopaque

1077

y

Ficoll-Histopaque

1077/1119 [English y Andersen, 1974; Sigma-Aldrich]. B. Esquema del sistema de centrifugación en gradiente de densidad OncoQuick. En el kit vienen los tubos de prolipropileno con el medio y la membrana porosa de separación celular. Tras depositar la sangre periférica se centrifuga la muestra a 4 ºC durante 20 min a 1.600Xg. Tras la centrifugación las células aparecen divididas entre la interfase, la membrana y el pellet. Las CTCs aparecen en la interfase celular plasma/medio de separación [Greiner Bio-one].

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A Doble gradiente Sangre de densidad

Plasma CTCs, monocitos y plaquetas

Ficoll 1,077

CTCs y granulocitos

Ficoll 1,119 B OncoQuick

Centrifugación

Sangre

Eritrocitos Centrifugación Plasma CTCs

Membrana Medio de separación

Plaquetas Leucocitos Eritrocitos

3.3.1.1.2. Sistemas de captura celular por filtros o membranas porosas Los filtros que se emplean en la captura de CTCs son membranas porosas, con un tamaño de poro determinado que permite retener a las células tumorales. Algunos ejemplos de estos sistemas son: •

Microfiltro en 3D de CTCs viables, desarrollado por Zheng y cols. (2011). El cual consiste en dos membranas con poros de 9 y 8 µm de diámetro, posicionadas en dos capas paralelas de forma que los poros no coinciden, y dejando un espacio entre sí donde quedan retenidas las CTCs. La membrana inferior disminuye la fuerza que se ejerce sobre la membrana citoplasmática de las CTCs, de forma que se mantiene la viabilidad celular. Tras la captura, las CTCs se pueden detectar por microscopía electrónica de barrido o por microscopía de fluorescencia o confocal.

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Ensayo de aislamiento de células epiteliales por su tamaño (ISET), desarrollado por Vona y cols. (2000). Este sistema filtra las muestras sanguíneas, inferiores a 1 ml de volumen, mediante un sistema de vacio a través de un módulo de filtración que lleva incorporada una membrana de policarbonato con poros de 8 µm de diámetro. Tras la filtración, la membrana es lavada y aparecen las células tumorales aisladas y retenidas en ella. Este sistema de filtrado se puede emplear tras el enriquecimiento de CTCs por centrifugación en gradiente de densidad, demostrando una mayor detección de células tumorales que cuando se emplea únicamente el sistema de captura celular por filtración [Kahn y cols., 2004].

3.3.1.2. Sistemas basados en las características biológicas de las células tumorales 3.3.1.2.1. Captura por ensayos de invasividad Estos métodos se denominan funcionales y permiten el enriquecimiento de la muestra basándose en las características invasivas de las CTCs. Las CTCs son capaces de degradar matrices de adhesión celular (CAM) e invadirlas, esta propiedad sirve para diferenciar CTCs de células no tumorales y de células tumorales no viables. Estos ensayos se realizan exponiendo la CAM a la sangre periférica de pacientes con cáncer, las CTCs de estas muestras se unen a la matriz, y posteriormente la invaden y la degradan. Lo que se hace es marcar la CAM fluorescentemente, de forma que cuando las CTCs la degraden queden marcadas debido a que ingieren fragmentos de la

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membrana (CAM+), a la misma vez se emplean anticuerpos epiteliales (anti-EpCAM, anti-ESA y anti-panCKs) marcados con fluorocromos diferentes a la CAM, para así realizar una doble marcación de estas células tumorales viables y poder reconocerlas por microscopía de fluorescencia (Figura 9). Además, las muestras son marcadas con un anticuerpo anti-panleucocitario (anti-CD45), para asegurar que las CTCs son CD45- [Fan y cols., 2009; Lu y cols., 2010]. Figura 9. Detección de células tumorales circulantes (CTCs) por ensayo de invasividad, muestra de sangre periférica de una paciente con cáncer de ovario (estadio IIIc). En las fotografías se pueden apreciar dos CTCs que han ingerido fragmentos fluorescentes de CAM (CAM+) y positivas para los marcadores epiteliales empleados (Epi+) (imagen de la izquierda y del medio). Las células hematopoyéticas se marcan con anti-CD45 y el revelado se hace por el sistema alcalin-fosfatasa (imagen de la derecha) [Fan y cols., 2009].

3.3.1.2.2.

Sistemas

de

inmunorosetones:

RosetteSep

(StemCell

Technologies ) Este sistema utiliza un cóctel de anticuerpos, que son complejos tetraméricos formados por la unión de cuatro anticuerpos: un anticuerpo anti-células hematopoyéticas (anti-CD2, -CD16, -CD19, -CD36, -CD38, -CD45 y -CD66b), un anticuerpo anti-eritrocitos (anti-glicoforina A), y dos anticuerpos de anclaje; o dos anticuerpos anti-glicoforina A, y dos anticuerpos de anclaje.

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El cóctel de anticuerpos se añade a la muestra sanguínea antes de realizar una centrifugación en gradiente de densidad, de forma que las células hematopoyéticas quedan marcadas y unidas entre sí formando inmunorosetones. Estos agregados celulares tienen una mayor densidad y tras la centrifugación se depositan en el pellet, mientras que las células tumorales, que quedan sin marcar, aparecen como una población enriquecida en la interfase plasma/medio de separación. Este sistema presenta una recuperación de células tumorales superior a los sistemas OncoQuick, pero menor que los sistemas que emplean anticuerpos monoclonales (mAbs) conjugados con partículas magnéticas [Königsberg y cols., 2010]. 3.3.1.2.3. Sistema basado en afinidad magnética con “sorting” celular El sistema MACS y los sistemas de microesferas magnéticas [AdnaTest BreastCancer (AdnaGen)], son sistemas que no interfieren ni en la viabilidad, ni en la funcionalidad celular. Están basados en el uso de partículas de óxido de hierro, de aproximadamente 50 nm de tamaño y biodegradables, conjugadas con mAbs. Estos mAbs pueden estar dirigidos contra los antígenos presentes en las células de interés, por ejemplo: EpCAM;

CKs

7/8;

y

MUC1

(selección

positiva)

(Figura

10)

[Molnar y cols., 2001; Fhem y cols., 2002; Gaforio y cols., 2003; Guo y cols., 2004; Fehm y cols., 2007; Königsberg y cols., 2010], o pueden reconocer antígenos de las células contaminantes de la muestra, por ejemplo, el antígeno común panleucocitario (anti-CD45) presente en las células de origen hematopoyético (selección negativa) [Guo y cols., 2004; Yang y cols., 2009].

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Una vez marcadas las células, se aíslan mediante la utilización de una columna y de un separador magnético. Con este sistema se consigue retener en el interior de la columna, a las células marcadas con el anticuerpo conjugado con las microesferas. La obtención de la población celular de interés se consigue, en el caso de la selección positiva, mediante la liberación de la columna del separador magnético; y en el caso de la selección negativa, recogiendo el líquido eluido de la columna. Figura 10. A. Esquema del sistema MACS de selección positiva de células tumorales circulantes (CTCs). 1. Marcación inmunomagnética de las CTCs con anticuerpos monoclonales conjugados con microesferas magnéticas. 2. Las CTCs quedan retenidas en la columna sometida a un campo magnético (separador magnético). 3. Tras retirar la columna del separador magnético las CTCs son eluidas en una fracción celular enriquecida [Miltenyi Biotec]. B. Cluster de CTCs aisladas por este método y detectadas por inmunocitoquímica en sangre periférica de una paciente neoadyuvante con cáncer de mama [Fotografía del grupo de investigación del Dr. Gaforio].

A

B

1. Marcación inmunomagnética de las CTCs

2. Selección positiva de las CTCs

3. Eluido enriquecido en CTCs

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3.3.1.2.4. Sistemas basados en ferrofluidos Son sistemas compuestos por coloides de 1 nm, cuyo corazón magnético está recubierto con albúmina sérica bovina (BSA) conjugado con anticuerpos, como la EpCAM, para capturar las células diana. Tras la incubación con las partículas coloidales sigue una separación magnética de las células marcadas. El sistema más conocido es el CellSearch® Circulating Tumor Cell Kit de Veridex, el cual contiene un reactivo de captura basado en un ferrofluido y reactivos inmunofluorescentes. El ferrofluido consiste en nanopartículas con un núcleo magnético rodeado de una capa polimérica revestida con anticuerpos dirigidos frente al antígeno EpCAM, para la captura de las CTCs. Este kit además de la captura inmunomagnética y el enriquecimiento, permite la detección de las CTCs añadiendo a la muestra reactivos fluorescentes: anti-CK-ficoeritrina (PE) (anti-CK 8/18/19), específico para células epiteliales; anti-CD45-aloficocianina (APC), específico para leucocitos; y DAPI, que marca los núcleos celulares [Veridex, LLC. Jhonson & Jhonson company]. La muestra es insertada, de forma automática, en un cartucho que se introduce en un dispositivo de presentación celular MagNest®. El fuerte campo magnético del dispositivo MagNest® atrae a las células epiteliales marcadas magnéticamente hacia la superficie del cartucho. La mezcla reactivo/muestra y la separación magnética se realiza mediante el CellTracks® AutoPrep® System, y la lectura de la muestra se realiza mediante el

CellTracks

Analyzer II®

o

CellSpotter® Analyzer

que

exploran

automáticamente toda la superficie del cartucho, adquieren las imágenes y muestran al usuario cualquier evento donde CK-PE y la fluorescencia DAPI aparezcan

en

el

mismo

lugar

[Cristofanilli

y

cols.,

Cristofanilli y cols., 2005; Cohen y cols., 2008; Swennenhuis y cols., 2009]. 50

2004;

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Tanto para los sistemas basados en las características físicas como citológicas, para demostrar el enriquecimiento exitoso en células tumorales, sería necesario analizar las porciones celulares no capturadas en el asilamiento celular [Köstler y cols., 2000; Kasimir-Bauer y cols., 2001].

3.3.2. Técnicas de detección de CTCs y DTCs Tras el enriquecimiento, que es del orden de 10.000 veces en las células de interés [Ring y cols., 2004], la muestra todavía presenta células contaminantes. Por lo tanto, se deben emplear métodos que permitan reconocer las células tumorales.

3.3.2.1. Técnicas histopatológicas convencionales Estos sistemas se emplean en cortes de tejido, generalmente nódulos linfáticos, incluidos en parafina o formalina. Por lo tanto, no es necesario aplicar un sistema de enriquecimiento previo. Los métodos histopatológicos convencionales utilizan protocolos de tinción con hematoxilina y eosina en combinación con un examen citológico para identificar las células tumorales. La valoración microscópica es subjetiva, y la diferenciación entre células atípicas y células no relevantes tiene que ser realizada por un citopatólogo experto. La aplicación de los métodos histológicos convencionales no abarca el análisis de médula ósea y sangre, debido a la gran presencia de células multinucleadas que aparecen en estos tipos de muestras [Zehentner, 2002].

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3.3.2.2. Técnicas inmunológicas 3.3.2.2.1. Técicas inmunohistoquímicas e inmunocitoquímicas La IHC (marcaje de céluas tumorales en tejido) y la ICC (marcaje de células tumorales en citospin o en frotis), pertenecen a un grupo de técnicas de inmunotinción que permiten demostrar la expresión de una gran variedad de antígenos presentes en las células, utilizando mAb conjugados con sistemas enzimáticos. Estas técnicas presentan una mayor sensibilidad y especificidad que las técnicas histopatológicas convencionales, y por lo tanto sirven para detectar células tumorales en nódulos linfáticos, médula ósea y sangre [Leikola y cols., 2005; Klevesath y cols., 2005]. Si estas técnicas se emplean sobre un corte de la muestra de estudio, no se precisa de un enriquecimiento previo y se realiza directamente la marcación. Pero, si se emplean en sangre o en aspirado de tejido es preciso el enriquecimiento de la muestra antes de la marcación de las células de interés [Pantel y cols., 2003]. Los mAbs que se emplean reconocen antígenos específicos, como pueden ser las mucinas y las CKs [Naume y cols., 2001; Benoy y cols., 2004; Slade y cols., 2005]. La expresión diferencial de las CKs, según el tipo de carcinoma, las convierten en unos marcadores útiles de subtipos histológicos [Moll y cols., 1982; Moll, 1991], y su grado de expresión en la célula viene determinado por el tipo de epitelio y el grado de maduración o diferenciación celular [Melchor y Benítez, 2008]. La detección de CKs, en un ambiente donde no se encuentra de forma habitual (como la sangre periférica), se ha propuesto como un marcador de células tumorales de origen epitelial [Gaforio y cols., 2003; Cristofanilli y cols., 2004; Cohen y cols., 2008] (Figura 10.B. Cluster de CTCs aisladas por este método y detectadas por ICC en sangre periférica de una paciente neoadyuvante con cáncer de mama). 52

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Los sistemas enzimáticos, conjugados con los mAbs que identifican a las células tumorales, más empleados son la peroxidasa y la fosfatasa alcalina. Pueden aparecer falsos positivos tanto debido a los mAbs, por ejemplo:

anti-mucinas

[Brugger

y

cols.,

1999]

y

anti-CKs

[Vagunda y cols., 2001]; como debido a los sistemas de revelado [Braun y Pantel, 1999], aunque la evaluación morfológica de estas células puede

ayudar

a

descartar

los

falsos

positivos

detectados

[Borgen y cols., 2006]. Aún así, usar el mAb y el sistema de revelado adecuado es crucial para la especificidad de la reacción y la identificación correcta de las células tumorales. Un límite que presentan estas técnicas es que el estudio de grandes volúmenes de material consume una gran cantidad de tiempo, por lo que la alternativa es el uso de sistemas automáticos o semiautomáticos [Borgen y cols., 2001; Witzig y cols., 2002; Pierga y cols., 2004; Cristofanilli y cols., 2005; Swenhenious y cols., 2009]. Una

variedad

de

estas

técnicas

de

detección

es

la

inmunofluorescencia (IF), la cual puede ser directa o indirecta. La IF se basa en emplear mAb primarios que van marcados con moléculas fluorescentes (IF directa); o sin marcar, los cuales son reconocidos por mAb secundarios marcados con moléculas fluorescentes (IF indirecta). Con esta técnica se eliminan los falsos positivos debidos a los sistemas de revelado enzimáticos. Actualmente, diversos grupos de investigación utilizan esta técnica para la detección de CTCs en sangre periférica [Cristofanilli y cols., 2004; Cristofanilli y cols., 2005; Cohen y cols., 2008; Swenhenious y cols., 2009].

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Una ventaja que presentan estas técnicas inmunológicas es que, tras el reconocimiento de las células tumorales en las muestras, posibilitan el estudio genético de las células detectadas [Fehm y cols., 2002; Meng y cols., 2004; Swenhenious y cols., 2009; Wind y cols., 2009]. Una modificación de la técnica de IF es la técnica de Inmunofenotipación y análisis citogenético en interfase fluorescente como herramienta

para

la

investigación

de

neoplasias

(Fluorescence

immunophenotyping and Interphase Cytogenetics as a Tool for Investigation Of Neoplasm, FICTION), desarrollada por Weber-Matthiesen y cols. en 1992. Esta técnica permite el análisis simultáneo del fenotipo y genotipo de las células

tumorales

[Weber-Matthiesen

y

cols.,

1992;

Weber-Matthiesen y cols., 1993] y ha demostrado ser útil en el estudio de neoplasias hematógenas [Nylund y cols., 1993; Haferlach y cols., 1997; Temple y cols., 2004; Young y cols., 2006] y algunos tumores sólidos [Terada y cols., 2000; Zhang y cols., 2000; Dettori y cols., 2003; Campos y cols., 2008]. 3.3.2.2.2. Técnicas de citometría de flujo Otra técnica inmunológica es la citometría de flujo (FC). A través de las técnicas de FC se consigue el aislamiento y la enumeración de las células tumorales,

de

forma

individual,

por

marcación

con

mAbs

[Moreno y cols., 2001; Beitsch y Clifford, 2001; Cornfield y cols., 2003; Rao y cols., 2005]. La FC permite la medición simultánea de múltiples características físicas y químicas de las células en suspensión, por lo tanto permite conocer el tamaño y la complejidad interna, además de realizar una evaluación quimíca y fenotípica de las células estudiadas.

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Hay que tener en cuenta que sólo un pequeño número de células tumorales son aisladas en la sangre de los pacientes con tumores sólidos, incluso en casos de pacientes metastásicos, en general menos de 10 células por ml. Debido a esto, estas técnicas de detección por FC no son las más precisas a la hora de detectar las células de interés en la muestra sanguínea [Swerts y cols., 2004]. Por lo tanto, es imprescindible la utilización de sistemas de enriquecimiento de la muestra para el uso de técnicas de detección por FC [Ring y cols., 2004]. Actualmente se están empleando técnicas de FC multiparamétricas que presentan una sensibilidad de detección alta, 10 células tumorales por mililitro de sangre (volumen total de 7,5 a 10 ml), demostrando que es posible la detección y fenotipación de las CTCs por esta metodología [Pluim y cols., 2012; Hristozova y cols., 2012; Fusi y cols., 2012].

3.3.2.3. Técnicas moleculares Los métodos moleculares empleados se basan en la detección de DNA y mRNA de las células tumorales en las muestras. En un principio, los métodos moleculares de detección de células tumorales eran usados en el estudio de la MRD de enfermedades hematológicas malignas, como la leucemia mieloide crónica o la leucemia linfoblástica aguda, y su uso se centraba en la detección de cambios genéticos [Miyamura y cols., 1992; Delage y cols., 1991]. Posteriormente, las técnicas moleculares demostraron ser útiles en la detección de células tumorales en pacientes con tumores sólidos, tanto en sangre en sangre periférica como médula ósea y nódulos linfáticos [Zehentner, 2002; Ghossein y Bhattacharya, 2000; Ring y cols., 2004; Mostert y cols., 2009].

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Inicialmente se empleaba la detección de DNA, pero ésta solo indica la presencia de ácidos nucléicos y no necesariamente de células tumorales, y su detección puede deberse al deterioro de las células tumorales. Por consiguiente, la presencia de marcadores de DNA, amplificados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), no confirman necesariamente la presencia de células tumorales viables pero son indicativo de la carga tumoral [Ghossein y Bhattacharya, 2000; Zehentner, 2002; Ring y cols., 2004; Mostert y cols., 2009]. Posteriormente se empezó a emplear la detección de mRNA [Chen y cols., 2000; Shaw y cols., 2000], ya que éste presenta una viabilidad baja en las muestras clínicas, y su detección sugiere que esté presente en el contexto de célula tumoral viable [Zehentner, 2002; Ring y cols., 2004; Mostert y cols., 2009; Beiske y cols., 2009]. La disponibilidad de la tecnología de PCR en tiempo real, o PCR cuantitativa (real time-PCR, qRT-PCR), ofrece nuevas ventajas incluyendo: reducción del riesgo de contaminación; cuantificación directa; alto rendimiento, debido a minimizar el proceso de lectura de la polimerasa; y el uso de programas de ciclo rápidos [Zehentner, 2002; Ring y cols., 2004; Mostert y cols., 2009]. Las técnicas moleculares presentan la ventaja de una alta sensibilidad, detección de 1 célula tumoral entre 107 células mononucleares, pero presentan una baja especificidad [Ghossein y Bhattacharya, 2000], aunque la qRT-PCR pemite discernir entre una expresión baja y alta del marcador estudiado, lo que aumenta el poder discriminar entre mRNA de células normales y de células tumorales [Mostert y cols., 2009]. Sin embargo, la aparición de falsos positivos es un problema importante cuando se emplean estas técnicas, ya que se produce la pérdida morfológica de la célula tumoral, y estos se suelen deber a: la presencia de pseudogenes

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[Tschentscher y cols., 1997; Smith y cols., 2001; Hurteau y Spivack, 2002]; la expresión ilegítima de los marcadores estudiados [You y cols., 2008]; o la existencia de células epiteliales no tumorales contaminantes en la muestra. Tanto en la detección de DNA como de mRNA por PCR o qRT-PCR, es necesario realizar diversos controles que aseguren la eficacia, sensibilidad y especificidad de la reacción [Ghossein y Bhattacharya, 2000], y seguir un protocolo que involucra varios pasos: • El primero paso es aislar las células mononucleares de la muestra. Normalmente, el primer paso es una centrifugación por gradiente de densidad [Koch y cols., 2005], aunque algunos grupos de investigación han

usado

la

separación

immunomagnética

directamente

[Chen y cols., 2005] o ambas técnicas [Pantel y Brakenhoff, 2004]. También es posible realizar la detección de DNA y mRNA en muestras de plasma y suero, por lo que no es preciso realizar un enriquecimiento de la muestra [Chen y cols., 2000; Shaw y cols., 2000]. • En el caso de la detección de DNA por PCR, el segundo paso es la obtención del DNA total de la muestra; el tercer paso es la amplificación por PCR, mediante cebadores específicos del marcador de DNA escogido; el cuarto paso es la detección de los productos obtenidos, para lo que se realiza una electroforesis en gel de agarosa y la marcación del DNA con bromuro de etidio u otro agente intercalente que sea fluorescente (por ejemplo, SYBR Green); y el paso final, es cuantificar semicuantitativamente los valores obtenidos, para poder extrapolar el tamaño de los fragmentos de DNA estudiado se usan marcadores de peso molecular, y se comparan los tamaños de las bandas de DNA diana con los resultados obtenidos de amplificar secuencias de genes

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constitutivos en las muestras y los resultados obtenidos en controles de voluntarios sanos, donde se realiza el mismo protocolo. • En el caso de la detección de mRNA por PCR, el segundo paso es la obtención del mRNA total; el tercer paso es la obtención, utilizando la transcriptasa inversa, del DNA complementario a éste (cDNA). A partir de aquí se trabaja igual que en el caso de la detección de DNA. Algunas veces, para aumentar la sensibilidad, se realiza una segunda reacción de PCR sobre el producto de la primera reacción de amplificación, utilizando cebadores diferentes [Huang y cols., 2003]. • En la detección de mRNA por qRT-PCR, se siguen los mismos pasos que antes, pero las enzimas, los cebadores y los termocicladores que se utilizan son diferentes. Con la qRT-PCR la cuantificación es cuantitativa, y se suele realizar comparando el cambio en los niveles de expresión del mRNA estudiado (curvas de los marcadores estudiados) con el nivel de expresión, obtenido usando el mismo protocolo de la qRT-PCR, de genes constitutivos en las muestras (genes de normalización). Además se puede establecer un rango normal en el ensayo empleando controles, de forma que se obtiene un punto de corte que se utiliza para identificar las muestras positivas y negativas, mejorando la especificidad del test [Schuster y cols., 2003; Ring y cols., 2004; Pantel, 2003]. Al igual que en los protocolos de detección por técnicas inmunológicas, la metodología basada en el estudio del DNA y mRNA es laboriosa, sobre todo la del mRNA. En la detección de CTCs y DTCs por técnicas moleculares se han empelado con éxito varios marcadores, por ejemplo en la detección de DNA se han utilizado: mutaciones en protooncogenes o en genes supresores de

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tumores [Conzelmann y cols., 2004]; inestabilidad de microsatélites [Shaw y cols., 2000; Schwarzenbach y cols., 2009]; secuencias oncogénicas virales [Kobayashi y cols., 1998; Im y cols., 2003]; o metilaciones del DNA [Umetani y cols., 2005]; en el caso de la detección de mRNA se han utilizado: «tránscritos asociados al tumor» como el CEA [Kim y cols., 2005; Wang y cols., 2005; Guo y cols., 2004], el antígeno asociado al melanoma [Kufer y cols., 2002; Sienel y cols., 2007], la subunidad β de la gonadotropina coriónica humana [Fabisiewicz y cols., 2004]; mucinas [Felton y cols., 2004; de Cremoux y cols., 2000], hTR y hTERT [Chen y cols., 2000]; y «tránscritos específicos de tejido» como el antígeno específico de la próstata [Ross y cols., 2005] en el caso del carcinoma de próstata, CKs [Yun y cols., 2000; Shaw y cols., 2000; Retz y cols., 2001; Felton y cols., 2004; Zhang y cols., 2005; Fabisiewicz y cols., 2004; Koch y cols., 2005] para tumores sólidos epiteliales, tirosinasa [Reinhold y cols., 2001] en casos de melanoma, y mamaglobulina [Suchy y cols., 2000; Corradini y cols., 2001; Fabisiewicz y cols., 2004] en tumores de mama (Tabla 1). Desde el año 2000 se está utilizando la técnica OSNA para la detección de DTCs en el SLN de forma intraoperatoria, la cual es una modificación de la qRT-PCR que permite la amplificación de ácidos nucléicos en un solo paso [Notomi y cols., 2000; Nagamine y cols., 2001], sin utilizar un método de enriquecimiento previo [Visser y cols., 2008; Schem y cols., 2009; Tsujimoto y cols., 2007].

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Tabla 1. Detección de CTCs y DTCs por métodos moleculares [Pantel y Otte, 2001]. Tejido de análisis Médula Ósea

Tipo de Tumor

Marcadores moleculares

Cáncer de mama

CK19, CEA, Mamaglobulina

Cáncer colorrectal

CEA, CK19, CK20

Cáncer de estómago

CEA, CK20

Cáncer de páncreas

CEA

Cáncer de próstata

PSA, CK19

Cáncer de mama

CK19, MUC1, β-hCG

Cáncer de cérvix

HPV16-E6/E7

Cáncer colorrectal

CEA, CK19, CK20, Mutaciones TP53 y K-ras

Cáncer de próstata

PSA, PSM

Cáncer de piel (melanoma)

Tirosinasa

Cáncer de pulmón

Mutaciones TP53 y K-ras

Cáncer de páncreas

Mutaciones K-ras

Cáncer de cabeza y cuello

Mutaciones TP53

Cáncer de mama a aa

CK19, EGFR, β-hCG, Telomerasa, Mamaglobulina

Cáncer colorrectal

Mutaciones K-ras, CK20

Cáncer de páncreas

Mutaciones K-ras

Cáncer de próstata

PSA, PSM

Cáncer de piel (melanoma)

Tirosinasa, MUC18, MAGE-3

Cáncer de pulmón

Alteraciones en microsatélites

Cáncer de estómago

CK20

Cáncer de hígado

α-Fetoproteína

Cáncer de cabeza y cuello

Alteraciones en microsatélites

Hígado

Cáncer de páncreas

Mutaciones K-ras

Resección de los márgenes tumorales

Cáncer de cabeza y cuello

Mutaciones TP53

Nódulos Linfáticos

Sangre

CEA = Antígeno carcinoembrionario; CK19 = Citoqueratina 19; CK20 = Citoqueratina 20; EGFR = Receptor del factor de crecimiento epidérmico humano; HPV16- E6/E7 = Genes E6 y E7 del papilomavirus humano tipo 16; K-ras = Gen K-ras; MAGE-3 = Antígeno 3 asociado a melanoma; MUC1 = Mucina 1; MUC18 = Mucina 18; PSA = Ántigeno específico de la próstata; PSM = Antígeno de membrana específico de la próstata; TP53 = Gen TP53; β-hCG = Subunidad β de la gonadotropina coriónica humana.

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

3.3.3. Otras técnicas de aislamiento y detección 3.3.3.1. Inmunospot epitelial El sistema Inmunospot epitelial (EPISPOT) es un método de detección funcional y consiste en la detección de proteínas, como MUC1, PSA o CKs, que son producidas y secretadas por las CTCs o DTCs en cultivo tras 48 horas. Antes de realizar el cultivo celular se emplea un enriquecimiento inmunomagnético negativo (marcación con CD45) y la muestra enriquecida se pone en contacto con placas de cultivo celulares tratadas, cuyas superficies presentan mAb específicos. Tras 48 horas de cultivo, las células son eliminadas y las placas de cultivo se lavan antes de ser marcadas con mAb

conjugados

con

fluorocromos

que

reconocen

las

proteínas

inmunocapturadas en las placas (Figura 11). Con este sistema solo se detectan células tumorales viables, y actualmente ha sido utilizado para detectar tanto CTCs como DTCs en pacientes con cáncer de mama y próstata [Alix-Panabières y cols., 2007]. Figura 11. Esquema del sistema EPISPOT: Placas tratadas con mAbs que se ponen en contacto con células tumorales aisladas de muestras clínicas de pacientes con cáncer. Tras 48 horas de cultivos las células secretan proteínas que quedan inmunocapturadas en la placa, tras retirar las células las placas son lavadas y marcadas con mAbs conjugados con fluorocromos [Alix-Panabières y cols., 2008].

1 Placas tratadas

2 Cultivo de 48 horas. Secreción de proteínas

3 Eliminación de las células tumorales y lavado de las placas

4 Detección con mAbs marcados con fluorocromos de las proteínas  inmunocapturadas en las placas

5 Lector automático

61

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

3.3.3.2. Sistema FAST La tecnología FAST emplea un escaneo láser fibro-óptico de matriz combinado con un sistema automatizado de microscopia fluorescente digital [Krivacic y cols., 2004]. Este sistema permite escanear unas 300.000 células por segundo con una alta sensibilidad y especificidad: el sistema FAST localiza las CTCs, las cuales son observadas a través del microscopio de fluorescencia y el sistema automatizado digital permite la captura de imágenes, posteriormente las CTCs son marcadas en Wright-Giemsa o Papanicolau, y se observan a través de un microscopio óptico [Marrinucci y cols., 2007; Marrinucci y cols., 2010]. Esta tecnología se ha empleado para detectar CTCs marcadas fluorescentemente y permite evaluar el pleomorfismo de las mismas, determinar el cociente núcleo/citoplasma y observar la cromatina [Marrinucci y cols., 2007; Marrinucci y cols., 2010; Marrinucci y cols., 2012]. Actualmente se ha empezado a utilizar esta metodología en la detección de CTCs de pacientes con tumores sólidos epiteliales [Marrinucci y cols., 2012; Cho y cols., 2012], donde se ha podido diferenciar CTCs individuales y agregados de estas células [Cho y cols., 2012].

3.3.3.3. Microchips 3.3.3.3.1. Microchip de aislamiento de células tumorales En 2007 un grupo de investigadores [Nagrath y cols., 2007] desarrolló un dispositivo que permitía el aislamiento, en un solo paso, de CTCs de sangre periférica sin procesar (sin un enriquecimiento celular previo). Este dispositivo es una cámara de silicio grabado con 78.000 micropostes que están recubiertos con el anticuerpo anti-EpCAM. A través de éste se hacen

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

pasar de 2 a 4 ml de sangre que fluye por todo el chip, la cinética del flujo ha sido optimizada de forma que el mayor número posible de CTCs entre en contacto con los micropostes recubiertos de anticuerpos. Las CTCs capturadas en los micropostes son visualizadas por la marcación con anticuerpos anti-CKs o por otros marcadores específicos. Con este sistema se consigue, tanto la enumeración de las CTCs, a través de la toma de imágenes del dispositivo completo usando un sistema de semiautomático; como realizar análisis moleculares de las CTCs aisladas (Figura 12). El chip de CTCs permite un alto rendimiento en la captura de CTCs (media

de

50

CTCs

por

mililitro)

y

de

pureza

(0,1%-50%)

[Nagrath y cols., 2007]. El límite principal de esta técnica es el tiempo que debe transcurrir entre la extracción de sangre y el análisis, que debe ser de unas pocas horas. Aunque gracias a esto y a que no existe fijación, las células siguen siendo viables tras la captura. Actualmente este ensayo es técnicamente difícil de realizar y no está estandarizado para conseguir un alto rendimiento, pero ofrece muchas posibilidades. Por ejemplo, esta metodología se ha empleado con éxito en pacientes con cáncer de pulmón [Maheswaran y cols., 2008], demostrando la posibilidad de realizar análisis moleculares en las CTCs y de monitorizar los cambios genéticos que pueden ocurrir durante el tratamiento. Además, han surgido varias modificaciones de este chip que mejoran la captura de CTCs, como es el “bosque de nanotubos” de carbono porosos [Chen y cols., 2011] o el chip microfluídico “nano-velcro” [Wang y cols., 2011a].

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Figura 12. A. Imagen de microscopía electrónica de una célula tumoral capturada en el microchip de CTCs. La línea celular NCI-H1650 de cáncer de pulmón fue mezclada con sangre periférica de un voluntario sano, y se aisló con el dispositivo de microfluidos (coloreada en rojo). El cuadro superior de la derecha muestra una imagen amplificada de la célula tumoral. B-I. Imágenes tomadas de CTCs capturadas (20x) y de células hematopoyéticas de un paciente con carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), marcadas con DAPI, CK y CD45. Las imágenes fusionadas de los paneles B-E (merge) muestran las CTCs, y las de los paneles F-I las células hematopoyéticas [Nagrath y cols., 2007]. CTCs

Leucocitos

3.3.3.3.2. Microchip ultrasónico de captura de CTC En 2010 investigadores españoles [González y cols., 2010] presentaron un nuevo microchip que permitía la separación y clasificación de partículas en suspensión en un líquido. Este microchip incluye un microcanal por el cual la muestra (fluido), que contiene las partículas en suspensión diana, fluye en paralelo con otro líquido. El principio de funcionamiento de este sistema se basa en el uso de ultrasonidos en la sección transversal del chip e incluye un nódulo de presión,

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

que está estratégicamente colocado en la parte del colector de fluídos, de forma que las partículas diana quedan retenidas en él. Con este chip se ha conseguido una alta eficiencia (95%) en la separación de partículas, a diferentes concentraciones y tasas de flujo, lo que demuestra la viabilidad del microchip para realizar la separación de partículas en suspensión en un líquido. Actualmente esta metodología no se ha empleado en muestras clínicas.

3.3.3.4. Nanopartículas En 2011 investigadores americanos [Wang y cols., 2011b] desarrollaron una nueva metodología que emplea la espectroscopia resonante superficial Raman amplificada, para cuantificar la presencia de CTCs en sangre. Este sistema emplea nanopartículas de oro recubiertas de un polímero conjugado con una proteína de bajo peso molecular, que en este caso es el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el cual se une a las CTCs. El uso de esta metodología en muestras clínicas, 19 pacientes con cáncer de cabeza y cuello, ha demostrado tener éxito, obteniendo un rango de detección de 1 a 720 CTCs por mililitro de sangre. Actualmente existen variaciones de esta metodología, como la que emplea Pallaoro y cols. (2011) que usan dos sets de nanopartículas de plata, uno funcionalizado con el péptido RPARPAR, que se une al receptor de la neuropilina-1 expresado en las células tumorales; y el otro, que actúa como control positivo, funcionalizado con un péptido derivado de la proteína TAT del HIV, el cuál se une tanto a células tumorales como a células normales. Actualmente estos investigadores solo han realizado ensayos in vitro con líneas celulares epiteliales, tumorales y no tumorales inmortalizadas, y han comprobado que tras la marcación con ambos sets de nanopartículas de

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

plata se pueden distinguir las células tumorales de las normales con una eficiencia bastante alta.

3.3.3.5. Sistema de filtración y eliminación de CTCs En 2011 investigadores americanos [Scarberry y cols., 2011] desarrollaron un sistema de filtración y eliminación de CTCs de líquido peritoneal. Estos investigadores emplean nanopartículas magnéticas funcionalizadas con ligandos, péptidos miméticos al efrina-A1 selectivos para el EphA2R, que se unen a receptores específicos en las células malignas. Este ensayo fue realizado en un modelo murino de cáncer de ovario en el cual tras extraer por paracentesis el líquido peritoneal, éste se mezcla con las nanopartículas magnéticas. Una vez realizada la marcación de las células tumorales, se realiza una filtración magnética y la muestra resultante es reintroducida intraperitonealmente en los sujetos de estudio. Así se obtuvo una reducción en el título de células tumorales, lo que prolongó significativamente la aparición de metástasis. Además, este grupo de investigación ha comprobado como es posible eliminar células tumorales en el líquido peritoneal de pacientes con cáncer de ovario, y sugieren que esta metodología podría aplicarse en tumores como las leucemias.

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

4.

Tipos de muestra La elección de la técnica de detección apropiada depende del tipo de

tejido o muestra que va a ser analizado y del origen histológico del tumor estudiado.

3.4.1. Nódulos linfáticos A la hora de estudiar los nódulos linfáticos, se realiza una linfadenectomía, que dependerá de la localización del tumor. Tras esta cirugía, se analizan los nódulos linfáticos a través de la realización de cortes seriados, lo que incrementa la posibilidad de detectar células tumorales [Pargaonkar y cols., 2003; Liu y cols., 2000]. La detección de células tumorales se puede realizar por técnicas histopatológicas convencionales, IHC o técnicas moleculares. No obstante, este procedimiento consume mucho tiempo por lo que no se realiza de forma rutinaria [Zehentner, 2002]. Las técnicas IHC que emplean mAb anti-CKs, en la detección de células tumorales o micrometástasis, tienen más sensibilidad que las técnicas histopatológicas convencionales [Passlick y Pantel, 2000; Péley y cols., 2001; Noguchi, 2001]. Sin embargo, hay que tener en consideración que en los nódulos linfáticos hay células no tumorales que expresan CKs, originando falsos positivos, y se debe realizar la valoración morfológica de las células que son detectadas como positivas para un correcto diagnóstico. En cáncer de mama [Péley y cols., 2001; Takei y cols., 2007] y melanoma [Landi y cols., 2000; Roberts y Cochran, 2004], se emplea una técnica de cartográfia de varios nódulos linfáticos de drenaje del tumor, que se denominanan técnica del SLN. El SLN son nódulos linfáticos de drenaje de una zona determinada, donde es más probable la detección de células

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

tumorales,

e

incluso

pueden

ser

los

únicos

ganglios

afectados

[Cabanas, 1977; Tanis y cols., 2001a]. La biopsia y estudio de los SLN puede ser un procedimiento útil en la evaluación de la enfermedad, por ser un método poco agresivo sobre todo si se compara con la disección completa de los nódulos linfáticos [Choi y cols., 2003; Doubrovsky y cols., 2004; Harish, 2005]. Actualmente no existe un consenso general que indique que esta técnica es útil en otros tipos de patologías tumorales, pero existen diferentes estudios que señalan la posibilidad de su uso, a la hora de evaluar la

diseminación

tumoral,

en

pacientes

con:

cáncer

de

colon

[Saha y cols., 2004; Bilchik y cols., 2006; Stojadinovic y cols., 2007a; Nordgård y cols., 2009a]; cáncer gastrointestinal [Ajisaka y Miwa, 2003]; cáncer de cuello y de cabeza [Payoux y cols., 2005]; cáncer oral y orofaríngeo [Nieuwenhuis y cols., 2005]. Las técnicas moleculares, sobre todo la RT-PCR y la qRT-PCR, se han usado con éxito y poseen una alta sensibilidad en la detección de células tumorales en nódulos linfáticos y SLN [Denninghoff y cols., 2004; Giese y cols., 2005; Nordgård y cols., 2009b]. Los marcadores que se emplean varían según el tumor estudiado (Tabla 2). El inconveniente general que tienen las técnicas de evaluación de los ganglios linfáticos y el SLN, es que los análisis se realizan tras la operación y tardan aproximadamente una semana en obtenerse los resultados. De forma que sería necesario volver a someter al paciente a una cirugía de eliminación de los nódulos linfáticos si los resultados son positivos (nódulos linfáticos o SLN con presencia de células tumorales). Algunos estudios realizados en pacientes

con

cáncer

de

mama

y

melanoma,

emplean

análisis

intraoperatorios del SLN por técnicas histopatológicas, para intentar evitar a los pacientes una segunda intervención quirúrgica, pero la sensibilidad de estos métodos no es muy alta [Tanis y cols., 2001b; Funasako y cols., 2010]. 68

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Tabla 2. Marcadores moleculares de detección de DTCs en nódulos linfáticos [Tímár y cols., 2002]. Tumor Primario

Marcador molecular mRNA/DNA

Cáncer de mama

CK19, CK20, MUC1, β-hCG, CEA, MGB1

Cáncer colorrectal

CK19, CK20, CEA, β-hCG, HGFR, TP53, K-ras, MGB2, MUC2, MMP7

Cáncer gástrico

CK19, CEA, MGB2

Cáncer de pulmón

MUC1, TP53, K-ras

Melanoma

Tirosinasa, MAGE-3, MART1

Cáncer de cabeza y cuello

SCC, TP53

Cáncer del tracto biliar

MGB2, CEA

Cáncer cervical

CK19, HPV, HPV18-E6, HPV16-E6/E7

Cáncer de próstata

PSA, PSM, hK2

Cáncer de páncreas

K-ras

Cáncer esofágico

CEA, MGB2

Como se ha comentado anteriormente (Tratamiento y progresión del cáncer de mama y colorrectal), en el año 2000 se empieza a emplear la técnica OSNA, para el análisis intraoperatorio del SLN, cuya utilidad clínica se ha comprobado inicialmente en pacientes con cáncer de mama, pero está obteniendo buenos resultados en otros tipos de tumores como el cáncer colorrectal. En cáncer de mama, también se emplea el ensayo de evaluación intraoperatorio, por PCR en tiempo real (qRT-PCR), de nódulos linfáticos de Veridex LLC (BLN assay), el cual está obteniendo resultados similares al OSNA [Tanis y cols., 2001b].

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

3.4.2. Médula ósea La aparición de metástasis en médula ósea es habitual en tumores de origen epitelial, y éstas suelen permanecer ocultas, ya que no son detectadas por los métodos diagnósticos habituales. Las muestras de médula ósea se pueden obtener por aspiraciones, durante la cirugía, y ser evaluadas por ICC [Naume y cols., 2001; Braun y cols., 2001a; Braun y cols., 2001b; Steinert

y

cols.,

2008]

(Figura

13)

o

por

técnicas

moleculares

[Dieterle y cols., 2004; Sienel y cols., 2007; Beiske y cols., 2009]. Figura 13. Detección por ICC de DTCs en médula ósea [Pantel y Barkenhoff, 2004]. El proceso se inicia con la utilización de un gradiente de ficoll para aislar las células mononucleares (MNCs), en esta fracción celular aparecen las células tumorales. Se emplean anticuerpos monoclonales (mAbs) frente a las CKs para identificar a las células eptiteliales tumorales metastásicas, la mayor parte de investigadores emplean combinaciones de mAbs que reconocen varias CKs o un mAb de amplio espectro que reconoce un epítopo específico común en la mayoría de las CKs. Esto se debe a que la expresión de las CKs se puede ver disminuida en tumores epiteliales como el cáncer de mama. El proceso de búsqueda de DTCs en las muestras citológicas se puede automatizar con los nuevos sistemas de análisis de imagen. Las dos imágenes de la figura (a la izquierda una célula aislada y a la derecha un cluster de dos células) son un ejemplo representativo de tres células que son marcadas con el mAB anti-CK A45-B/B3. Las células de médula ósea que rodean a las DTCs aparecen sin marcar, excepto por una marcación ligera nuclear debido a la contratinción de DNA que se emplea, lo que permite la cuantificación de todas las células de los portaobjetos. Se están desarrollando diferentes procedimientos para el enriquecimiento de células tumorales, utilizando varios gradientes de densidad y partículas magnéticas combinadas con mAbs, para mejorar la detección de las DTCs. Actualmente no está claro si estos nuevos procedimientos proporcionan más información que la obtenida por el procedimiento estándar de gradiente de densidad utilizado para aislar MNCs [Wiedswang y cols., 2003]. Imagen de las DTCs del trabajo de Pantel y cols. (2003).

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Extracción de médula ósea de cresta ilíaca

Médula ósea

MNCs

Gradiente de ficoll

Búsqueda de DTCs

Marcación con mAb anti-CK A45-B/B3

Sin embargo, existe una gran diferencia en los resultados obtenidos por diferentes grupos. Estas diferencias se deben principalmente a la variedad de anticuerpos utilizados, para la detección de células tumorales, y las diferentes metodologías empleadas [Borgen y cols., 2006]. Por lo tanto, es fundamental estandarizar un método, que permita comparar los resultados entre los diferentes grupos, y realizar estudios multicéntricos. La sensibilidad de detección de DTCs en médula ósea por técnicas moleculares es mayor que la de la ICC [Pantel y cols., 2003; Vogelaar y cols., 2010]. Pero estas son técnicas menos específicas, que presentan falsos positivos y negativos, y la carencia de la existencia de marcadores tumorales específicos limita su aplicación. El análisis de médula ósea y su implantación en la clínica, implica ciertos problemas, posiblemente el de mayor envergadura sea el que la obtención de médula ósea es un proceso doloroso para el paciente, que requiere personal cualificado y ciertas condiciones que impiden su implantación como técnica ambulatoria de rutina. Por este motivo, en los

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

últimos años muchos estudios se han centrado en la detección de CTCs, en sangre venosa periférica, de pacientes con tumores sólidos.

3.4.3. Sangre La principal ventaja de utilizar este tipo de muestra para la detección de CTCs, es que la extracción de sangre periférica es un procedimiento habitual y en ella se realizan la mayoría de las determinaciones analíticas, tanto en clínica hospitalaria como ambulatoria. Además, es un proceso poco invasivo, no doloroso, se pueden obtener muestras de sangre cuantas veces sea necesario, y no requiere de un personal muy cualificado ni de otros requerimientos especiales, lo que la hace ideal para el seguimiento de la enfermedad. El estudio de la presencia de CTCs en sangre se ha abordado desde distintos puntos de vista. Se ha utilizado para ello diferentes tipos de muestras: desde sangre periférica [Koch y cols., 2005; Chen y cols., 2005], a suero o incluso plasma [Chen y cols., 2000; Shaw y cols., 2000]. Las técnicas de detección empleadas también varían, una de las más usadas es la RT-PCR que se ha utilizado para demostrar la presencia de CTCs, y para predecir una posible recaída de la enfermedad [Zehentner, 2002; Ring y cols., 2004; Mostert y cols., 2009]. En el caso de la utilización de técnicas inmunológicas, éstas permiten, además, la identificación directa de las CTCs [Gaforio y cols., 2003; Cristofanilli y cols., 2004], y por lo tanto, completar el estudio con análisis morfológicos; fenotípicos; e incluso, genotípicos de las mismas [Fehm y cols., 2002; Meng y cols., 2004a; Wind y cols., 2009; Campos y cols., 2008; Swennenhuis y cols., 2009]. La detección de CTCs puede verse afectada por el momento en que se realice la extracción de la muestra sanguínea, por ejemplo: el tratamiento

72

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

quimioterápico

afecta

a

la

presencia

de

CTCs

en

la

sangre

[Camara y cols., 2007; de Bono y cols., 2008; Pachmann y cols., 2008]; el tratamiento hormonal puede generar una regulación baja de la expresión del marcador tumoral de interés, por ejemplo: los antiandrógenos interfieren en la expresión de PSA [Sauter y cols., 1998; Sauter y cols., 2002]. Por tanto, un estudio completo debería incluir extracciones secuenciales que definan el número de CTCs antes, durante y al final de la terapia, de forma que nos determinen con más exactitud tanto el vertido tumoral a sangre, el cual que se piensa que ocurre intermitentemente y desde estadios tempranos de la enfermedad [Weitz y cols., 1998; Gaforio y cols., 2003; Meng y cols., 2004b], como la eficacia de la terapia administrada [Köstler y cols., 2004a; Köstler y cols., 2004b; Mazouni y cols., 2007; Camara y cols., 2007; de Bono y cols., 2008; Pachmann y cols., 2008; Cohen y cols., 2008; Pachmann y cols., 2011]. Actualmente no se conoce si existe una extracción, que realizada en un determinado momento de la evolución de la enfermedad, nos de la mayor información posible sobre ésta. La pérdida de especificidad en el ensayo puede ocurrir por la pequeña proporción que existe de CTCs comparadas con la cantidad de células hematopoyéticas presentes (aproximadamente 1 célula tumoral entre 106-107 células nucleares) o por la variación en la expresión del marcador utilizado en el estudio [Fehm y cols., 2002; Antolovic y cols., 2010; Willipinski-Stapelfeldt y cols., 2005; Paterlini-Brechot y Benali, 2007; Rao y cols., 2005; Effenberger y cols., 2011; Mikolajczyk y cols., 2011]. Así pues, tanto la técnica escogida como el marcador utilizado para la detección son cruciales para obtener la mayor sensibilidad y especificidad posible [Ko

y

cols.,

2000;

Silva

y

cols.,

2001;

Vlems

y

cols.,

2002;

Schuster y cols., 2004].

73

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Los marcadores moleculares empleados varían dependiendo del tipo de tumor estudiado, y pueden ser: CEA, CK20, EGFR y mucinas, en cáncer del tracto

gastrointestinal

y

de

vejiga

[Soeth

y

cols.,

1997;

Hardingham y cols., 2000; Gazzaniga y cols., 2001; Retz y cols., 2001; Tsouma y cols., 2010]; PSA en cáncer de la próstata [Ross y cols., 2005; Chen y cols., 2005]; tirosinasa, p97 y MelanA/MART1 en melanoma [Kunter y cols., 1996; Gogas y cols., 2002; Palmieri y cols., 2003]; péptido liberador de gastrina, SCG3 y marcadores de muerte celular (neopéptidos de CK18 escindidos por caspasas y DNA nucleosomal), en cáncer de pulmón [Lacroix y cols., 2001; Saito y cols., 2003; Moss y cols., 2009; Hou y cols., 2009]; y CK19, CEA, HER2 y MUC1 en cáncer de mama [Zach y cols., 1999; de Cremoux y cols., 2000; Felton y cols., 2004; Ignatiadis y cols., 2008; Chen y cols., 2010]. Los marcadores inmunológicos utilizados no varían tanto, basándose más en marcadores específicos de tejido, como son los marcadores de subtipos histológicos, que en marcadores asociados al tumor, aunque estos últimos también se han empleado, por ejemplo la detección de CTC que expresan HER2 (CTC HER2+) [Stojadinovic y cols., 2007b; Fehm y cols., 2010; Ignatiadis y cols., 2011]. Los marcores inmunológicos más utilizados son: CKs 8/18/19

[Cristofanilli

y

cols.,

2004;

Cristofanilli

y

cols.,

2005;

Cohen y cols., 2008; Wind y cols., 2009; Swennenhuis y cols., 2009]; y CKs 7/8 [Molnar y cols., 2001; Fehm y cols., 2002; Gaforio y cols., 2003]. Previa a la detección de las CTCs, la mayoría de los grupos de investigación realizan un enriquecimiento de la muestra. Como se ha indicado antes, los procedimientos utilizados son la centrifugación en gradiente de densidad [Fehm y cols., 2002; Gaforio y cols., 2003], la lisis de eritrocitos [Rolle y cols., 2005; Camara y cols., 2006; Yang y cols., 2009],

74

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

filtración [Vona y cols., 2000; Kahn y cols., 2004] y el enriquecimiento inmunomagnético

[Molnar

y

cols.,

2001;

Fehm

y

cols.,

2002;

Gaforio y cols., 2003; Cristofanilli y cols., 2004; Ulmer y cols., 2004; Cohen y cols., 2008; Swennenhuis y cols., 2009]. No obstante, hay que tener presente que la utilización de estos y otros procedimientos implica la posibilidad de cierta pérdida de células tumorales durante el procesamiento de la muestras. Así, las variaciones en los rangos de detección de los distintos grupos se deben, entre otras cosas, a las distintas técnicas utilizadas en cada laboratorio. A pesar de ello, podemos considerar que los protocolos de enriquecimiento celular son recomendables y pueden aumentar la sensibilidad de la detección de CTCs en sangre periférica [Guo y cols., 2004]. El procedimiento de enriquecimiento celular de la muestra más utilizado es el aislamiento celular por inmunoselección. En el caso de la selección positiva, hay que tener en cuenta la heterogeneidad de cada tumor, ya que cada tipo expresa no sólo diferentes antígenos epiteliales específicos, sino también diferentes niveles de expresión de estos antígenos. Por consiguiente, las células tumorales pueden escapar a esta selección [Fehm y cols., 2002; Willipinski-Stapelfeldt y cols., 2005; Rao y cols., 2005; Antolovic y cols., 2010; Effenberger y cols., 2011; Mikolajczyk y cols., 2011; Paterlini-Brechot y Benali, 2007], y para demostrar el enriquecimiento exitoso sería necesario analizar las porciones celulares no capturadas. El método de selección negativa posibilita el uso de muestras más grandes y puede mejorar la sensibilidad de la técnica [Naume y cols., 1998]. Sin embargo, los protocolos disponibles no erradican completamente la presencia de células hematopoyéticas, pudiendo quedar atrapadas las células tumorales entre éstas y pasando de esta forma inadvertidas. También es posible realizar la combinación de ambos métodos de selección, positiva y negativa, para mejorar los resultados obtenidos [Guo y cols., 2004].

75

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

3.4.4. Otros tipos de muestra La detección de células tumorales en otros tejidos diferentes a nódulos linfáticos, médula ósea y sangre, puede proporcionar una valiosa información sobre el pronóstico de la enfermedad en ciertos tipos de tumores. Por ejemplo, la detección de células tumorales en lavados peritoneales de pacientes con cáncer de páncreas o colon, por ICC, ha demostrado

tener

valor

pronóstico

[Vogel

y

cols.,

2002;

Hoffmann y cols., 2007]. En el cáncer de pulmón se usan nuevas técnicas moleculares

para

descubrir

células

tumorales

en

el

esputo

[Palmisano y cols., 2000; Belinsky y cols., 2005]. En el caso de cáncer urotelial, se están utilizando multisondas (marcación de varios genes con distintos fluorocromos) para el análisis citogenético por FISH, obteniendo una gran sensibilidad y especificidad en la detección de células tumorales en la orina y en lavados de vejiga [Bubendorf y cols., 2001; Bergman y cols., 2008]. También se utilizan técnicas moleculares para la detección de mutaciones de DNA en muestras de heces de pacientes con cáncer colorrectal [Dong y cols., 2001; Calistri y cols., 2003]. En el caso de pacientes con tumores de mama, se usan aspirados del pezón o fluidos de lavados ductales, para la detección de marcadores moleculares que puedan predecir la presencia de la enfermedad [Sauter y cols., 2002; Sauter y cols., 2007], o metilaciones del DNA [Lee y cols., 2004; Fackler y cols., 2006].

76

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

5.

Características biológicas de las CTCs y las DTCs La caracterización de las CTCs y las DTCs tiene dos objetivos básicos:

primero, indicar su origen tumoral, y segundo, identificar otras características celulares que puedan ser utilizadas a la hora de emplear terapias dirigidas o individualizadas.

3.5.1. Características morfológicas La morfología característica de las CTCs y las DTCs es de células típicamente tumorales, es decir, células de un tamaño mediano-grande y nucleadas, con un gran ratio núcleo/citoplasma y núcleo, generalmente, granulado.

Aunque

suelen

ser

células

pleomórficas

(Figura

14)

[Marrinucci y cols., 2007; Marrinucci y cols., 2010]. Figura 14. Pleomorfismo de las CTCs detectadas en sangre periférica de pacientes con cáncer colorrectal metastásico, utilizando: fluorescencia y marcación Papanicolau [Marrinucci y cols., 2010]. Tipos representativos de CTCs identificadas en los pacientes. Izquierda: Marcación fluorescente de las CTCs; Rojo: Alexa 555-CK, y Azul: DAPI. Derecha: Marcación Papanicolau de las correspondientes CTCs.

7,5 µm

7,5 µm

7,5 µm

7,5 µm

77

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

3.5.2. Características fenotípicas La característica fenotípica principal de las CTCs y las DTCs de tumores de origen epitelial es la expresión de marcadores epiteliales, como son las CKs y la EpCAM. Hay que tener en cuenta que tanto las CTCs como las DTCs han atravesado la EMT, en el caso de las DTCs también el proceso inverso (MET), por lo que estas células tumorales varían la expresión de las CKs y la EpCAM, e incluso llegan a no expresarlas [Pantel y cols., 1994; Thiery, 2002; Fehm y cols., 2002; Willipinski-Stapelfeldt y cols., 2005; Rao y cols., 2005; Paterlini-Brechot

y

Benali,

2007;

Antolovic

y

cols.,

2010;

Effenberger y cols., 2011; Mikolajczyk y cols., 2011]. Otras características fenotípicas (Tabla 3) de las CTCs y las DTCs son: 1. Expresión de HER2, la cual se puede emplear para: una mejor clasificación de los pacientes, como en los estudios de Braun y cols. (2001c), Schindlbeck y cols. (2005) y Wülfing y cols. (2006), donde se observa que la expresión de HER2 en las CTCs y DTCs (células CK+) se correlaciona con una menor supervivencia y tiempo libre de enfermedad en pacientes con cáncer de mama; la evaluación de la respuesta frente a tratamientos específicos [Ignatiadis y cols., 2011; Solomayer y cols., 2006; Krawczyk y cols., 2009]; e incluso para estudiar la biología de la progresión tumoral [Solomayer y cols., 2006; Wülfing y cols., 2006]. En algunos de estos estudios se observa como la expresión de HER2 aparece en las DTCs y CTCs (células CK+ o EpCAM+ o MUC1+) de pacientes con tumores primarios

de

mama

HER2

negativos

[Becker

y

cols.,

2005;

Solomayer y cols., 2006; Fehm y cols., 2007; Pestrin y cols., 2009; Tewes y cols., 2009; Krawczyk y cols., 2009; Fehm y cols., 2010;

78

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Somlo y cols., 2011]. Por ejemplo, Fhem y cols. (2010), evaluaron la expresión de HER2 en las CTCs aisladas de sangre periférica de pacientes con cáncer de mama metastásico, utilizando el ensayo CellSearch (células EpCAM+) y el AdnaTest BreastCancer (células EpCAM+ y MUC1+), y lo compararon con la expresión de esta proteína en el tumor primario. Sus resultaros mostraron que, considerando solamente los pacientes que eran CTCs+ en ambos test [62 (50% CellSearch y 39% AdnaTest BreastCancer)], el 50% (31/62) presentaban CTCs HER2+ (41% CellSearch y 47% AdnaTest BreastCancer), además, la detección de CTCs HER2+ aparecía también en pacientes cuyo tumor primario era HER2-. Los resultados de varios estudios indican que la expresión de HER2 aparece durante la progresión tumoral y, además se debe tener en cuenta la expresión de ésta proteína en las CTCs y las DTCs para poder administrar tratamientos frente al HER2. 2. Expresión de EGFR, la cual se puede emplear para definir tratamientos más

específicos

y

evaluar

la

respuesta

frente

a

estos

[Schlimok y Riethmüller, 1990; Liu y cols., 2010; Punnoose y cols., 2010]. Liu y cols. (2010), presentaron el caso de una mujer con cáncer de mama metastásico (ER-, RP-, HER2+ y EGFR+ solo en el 2% del tumor) a la cual, tras varios tratamientos de quimioterapia, se le realiza una extracción de 20 ml de sangre periférica para la detección de CTCs. Se detectaron 28 CTCs (células CK+) de las cuales 24 expresaban EGFR (80%), por lo que se inició un tratamiento con capecitabina y lapatinib y se monitorizaron las CTCs en sangre durante el mismo, obteniendo: en las primeras semanas una disminución de 8 veces en el número de las CTCs aisladas, además de una disminución del 50% del tumor; tras nueve semanas de tratamiento, la desaparición de las CTCs (no se detectaron) y se produjo una reducción de las lesiones del 80%; tras 18 semanas de tratamiento un aumento del marcador CA 15.3 y la detección de 2 CTCs EGFR-, este resultado se

79

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

mantuvo tras 30 y 42 semanas de tratamiento. La conclusión a la que llegaron estos autores es que, este caso demuestra como es posible utilizar la detección y fenotipación de CTCs para definir los tratamientos opcionales que pueden emplearse de forma personalizada en los pacientes. 3. Variación de la expresión del ER, la cual se puede emplear para una mejor clasificación de los pacientes y la evaluación de la respuesta frente a tratamientos específicos, e incluso para estudiar la biología de la progresión tumoral [Fehm y cols., 2008; Aktas y cols., 2011; Somlo y cols., 2011]. En el estudio de Fehm y cols. (2008), se observa como la expresión del ERα, detectada por IF, desaparece en las DTCs (células CK+) [42% (107) de los pacientes presentaba DTCs; la evaluación de la expresión de ERα en estas células fue: 88% ERα-; 12% ERα+; y 26% expresión heterogénea de ERα], aisladas de pacientes con cáncer de mama de tumores primarios ERα+ (82% tumores primarios ERα+; concordancia entre la expresión de ERα en el tumor primario y las DTCs del 28%). Lo que podría explicar la pérdida de efectivadad del tratamiento hormonal en estos pacientes. 4.

Expresión del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHCI), la cual se puede emplear para estudiar la evolución de la enfermedad y la biología de la progresión tumoral [Pantel y cols., 1991; Zia y cols., 2001]. Zia y cols. (2001) evaluaron la expresión del HLA I (antígeno leucocitario humano clase I) en las DTCs (células CK+) aisladas en aisparados de médula ósea de 30 pacientes con cáncer de mama en estadio M0. Sus resultados mostraron que 16 pacientes (53,3%) presentaban expresión de HLA I, mientras que 6 (20%) presentaban una pérdida parcial de éste. Además, las DTCs que se detectaron con pérdida parcial o total del HLA I

80

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

derivaban de pacientes cuyo tumor primario era pobremente diferenciado y su presencia se asoció a una supervivencia menor de la población. 5. Carencia de expresión de Ki67, tanto en DTCs como CTCs, lo cual indica que la mayor parte de estas células tumorales se encuentran en fase G0 (estado de dormancia). El estudio de la expresión de ésta proteína en las CTCs y las DTCs se puede emplear para evaluar la respuesta a los tratamientos quimioterápicos [Pantel y cols., 1993a; Müller y cols., 2005]. En el estudio de Müller y cols. (2005), se analizaron 47 (23 pacientes M0 y 24 pacientes M1) muestras de sangre periférica de pacientes con cáncer de mama, antes y después de haber recibido terapia sistémica, para detectar las CTCs (células CK+) y analizar la expresión de Ki67 en éstas. Sus resultados mostraron que 9 de los 47 pacientes (1 paciente M0 y 8 pacientes M1) presentaban CTCs y ninguna de estas células tumorales expresaba el marcador Ki67, lo que indica que la proliferación de las CTCs es un evento raro e independiente del tratamiento o del estado de la enfermedad. 6.

Expresión del marcador de apoptosis M30, el cual se puede emplear para evaluar la repuesta de los pacientes a la terapia administrada [Larson y cols., 2004; Fehm y cols., 2006; Swennenhuis y cols., 2009]. Fehm y cols. (2006), analizaron 157 aspirados de médula ósea de pacientes con cáncer de mama para detectar DTCs apoptóticas. Sus resultados mostraron que el 26% (36/157) de los pacientes presentaban DTCs (células CK+) M30+ o apoptóticas, de los cuales 17 solo poseían DTCs apoptóticas y 19 presentaban tanto DTCs apoptóticas como no apoptóticas. Debido a que no se detectaron DTCs apoptóticas en los pacientes que presentaban progresión de la enfermedad, y a que sí se detectaron en el 14% de los pacientes con remisión parcial o completa vs.

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

el 4% de los pacientes con enfermedad estable, estos autores concluyeron que la presencia de DTCs apoptóticas reflejaba la respuesta a la terapia. Además, un subgrupo de pacientes con enfermedad estable y remisión parcial o completa, presentaban tanto DTCs apoptóticas como no apotóticas, lo que mostraba una respuesta heterogenea a la terapia. 7.

Expresión de p53 mutada en DTCs, la cual se puede emplear para estudiar la progresión tumoral y como diana terapeútica [Offner y cols., 1999]. Offner y cols. (1999) analizaron los aspirados de médula ósea de 114 pacientes con tumores sólidos epiteliales (cáncer de pulmón, colorrectal, mama, estómago, páncreas, tracto urogenital y de origen desconocido), para detectar DTCs y estudiar en éstas la expresión de la proteína p53 mutada por ICC. Los resultados obtenidos en este estudio mostraron que 46 de los pacientes (40%) presentaban DTCs en médula ósea y solo 4 pacientes [3,5% de los 114 pacientes; o el 8,7% de los pacientes con DTC (4/46)] presentaban la proteína mutada con heterogeneidad de la marcación. Además, en este estudio se comprobó que la expresión de p53 mutada en el tumor primario de 47 pacientes con cáncer de pulmón (46,8%, 22/47 p53+), se correlacionaba con la presencia de células tumorales en nódulos linfáticos pero no en médula ósea. Por lo que los autores postularon que la mutación de p53 no es un evento necesario para la diseminación hematógena pero parece favorecer la diseminación en el cáncer de pulmón.

8. Expresión de EMMPRIN, la cual se puede emplear para estudiar la evolución de la enfermedad y la biología de la progresión tumoral [Reimers y cols., 2004; Buergy y cols., 2009]. Reimers y cols. (2004), evaluaron la expresión de EMMPRIN en las DTCs (células CK+) aisladas de 31 pacientes con cáncer de mama M0, sus resultados mostraron como

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

esta proteína era altamente expresada por las DTCs independientemente de su expresión en el tumor primario [35,0% de las muestras de médula ósea eran CK+ (11 muestras de las 31 analizadas (11/31). En las que se encontraron 38 células CK+]; 89,0% de las células CK+ (34/38) expresaban EMMPRIN. Como control postivio de este estudio, se evaluó la expresión de EMMPRIN en 1 paciente M1 en el que se detectaron 190 DTCs, de las cuales 169 expresaban EMMPRIN (89,0%). En este trabajo un bajo porcentaje células mononucleares expresaba EMMPRIN. 9. Expresión del receptor del activador del plasminógeno tipo uroquinasa (uPAR), el cual se puede emplear para estudiar la evolución de la enfermedad

[Allgayer

y

cols.,

1997;

Heiss

y

cols.,

2002;

Thomas y cols., 2009]. Heiss y cols. (2002), observaron que aquellos pacientes con cáncer próstata que presentaban DTCs (células CK+; 97/157 pacientes) con expresión de uPAR (51,92%; 81/156 pacientes) mostraban una menor supervivencia y un menor tiempo libre de enfermedad, indicando que este marcador podría ser un factor pronóstico independiente. Además la expresión de uPAR en las DTCs se correlacionaba con el estadio tumoral y la expresión de uPAR y PAI-1 en el tumor primario. 10.Fenotipo CD44+/CD24-/bajo. El trabajo de Al-Hajj y cols. (2003), sugiere que solamente un tipo de células tumorales, CSC o células iniciadoras del cáncer, son las que poseen capacidad tumorigénica. En cáncer de mama estas células se identifican con el fenotipo CD44+/CD24-/bajo, y solamente 100 de éstas células, extraídas de pacientes, son capaces de generar el tumor en ratones inmunocomprometidos generando células tumorales de diferentes líneas. Estás CSC representan una población baja (10-20%) en el tumor primario [Abraham y cols., 2005]. Debido a que estas células son las

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

iniciadores del cáncer, sería necesario desarrollar terapias específicas que afecten a esta subpoblación celular. Balic y cols. (2006) analizaron el porcentaje de células con fenotipo CD44+/CD24-/bajo que se podían detectar en aspirados medulares de pacientes con cáncer de mama en estadio M0, en los que se había detectado previamente la existencia de DTCs (células CK+). Sus resultados mostraron que éste fenotipo de células madre putativas se podía encontrar en todas las muestras con células CK+. La prevalencia media de estas células con fenotipo CD44+/CD24-/bajo fue del 72% y del 65% (33%-100%) entre las DTCs totales por paciente. Este trabajo, es la primera evidencia de la existencia de una subpoblación de células con fenotipo de células madre/progenitoras putativas dentro de las DTCs detectadas en médula ósea. Debido a que estos autores encontraron este fenotipo celular en todos los pacientes en los que se detectaron células CK+, sus resultados sugieren que la mayoría de los pacientes que presentan DTCs en médula ósea pueden tener un riesgo de por vida para presentar la recaída de la enfermedad. Actualmente hace falta asociar la presencia de estas células con fenotipo de células madre/progenitoras putativas con los factores clínicos de riesgo aceptados, el tiempo libre de progresión y la supervivencia global de la población. La detección de esta subpoblación celular, en pacientes sometidos a cirugía del tumor primario en estadios tempranos de la enfermedad, podría explicar los fallos que se producen al aplicar la quimioterapia adyuvante. Alix-Panabières y cols. (2007) detectaron células con fenotipo de células madre putativas CK19+/MUC1-, siendo éste otro fenotipo que se le ha asociado a las CSCs (células ESA+MUC1-, las cuales pueden expresar posteriormente CK19) [Gudjonsson y cols., 2002], en médula ósea de pacientes con cáncer de mama y próstata. Sus resultados mostraron que el número de DTCs detectadas era inferior en los pacientes

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

M0 que en los pacientes M1, pero que la mayoría de las DTCs detectadas en los pacientes M0 tenían un fenotipo CK19+/MUC1-. Estos resultados, junto con otros de este mismo grupo de investigación, demuestran que las DTCs en pacientes con cáncer de mama y próstata son viables y heterogéneas, en cuanto a la secreción de proteínas, y hace falta una caracterización más profunda de las células CK19+/MUC1- para identificar a las células madre putativas. 11. Expresión de marcadores de la EMT. En el trabajo de Aktas y cols. (2009) se realizó la monitorización del número de CTCs a 39 pacientes con cáncer de

mama

metastásico

durante

el

tratamiento

(quimioterapia,

hormonoterapia o con anticuerpos), y los pacientes fueron divididos según su respuesta a éste. En este trabajo se analizaron 226 muestras de sangre para la detección de CTCs con el sistema Adna Test Breast Cancer (enriquecimiento inmunomagnético con los mAbs anti-EpCAM y anti-MUC1), tras este enriquecimiento se analizaron las muestras para los tránscriptos de EpCAM, MUC1 y HER2; marcadores de EMT: Twist1, Akt2 y PI3Kα; y el marcador de células madre ALDH1. Los resultados de este estudio mostraron que: el 31% (69/226) de las muestras eran positivas para la detección de CTCs; en el grupo de muestras CTCs+ el 62% eran positivas para la detección de al menos uno de los marcadores de la EMT y el 69% eran positivas para ALDH1; en el grupo de muestras CTCs- los porcentajes fueron 7% y 14%, respectivamente. Por lo que una proporción elevada de las CTCs aisladas en los pacientes con cáncer de mama metastásico presenta características de la EMT y de células madre. Además, se observó que existía una mayor expresión de los marcadores de la EMT y células madre en la población de pacientes que no respondía al tratamiento, 62% (EMT) y 44% (ALDH1) vs. 10% (EMT) y 5%, (ALDH1), en los pacientes que si respondían al tratamiento, lo que podría indicar la

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Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

utilidad de estos marcadores para identificar una subpoblación celular resistente a la terapia, y ser utilizados como marcadores de mal pronóstico. Tabla 3. Características fenotípicas de las CTCs y las DTCs. [Modificación de la tabla de características fenotípicas de las DTCs (CK+) de médula ósa, publicada por Pantel y Braun (2001)].

Marcador

Tumor

DTC o CTC

Nº de pacientes con CTC/DTC que expresan el marcador (%)

Estudio

Marcadores histológicos PSA

Próstata

DTC

5/13 (38,5%).

Riesenberg y cols., 1993

CD45

Mama/CRC Mama Colon Próstata

DTC CTC CTC CTC

0; 0. 0. 0. 0.

Schlimok y cols., 1987 Cristofanilli y cols., 2004 Cohen y cols., 2008 Swennenhuis y cols., 2009

Vimentina

Mama/CRC

DTC

0.

Pantel y cols., 1994

Próstata

DTC

0.

Mueller y cols., 1998

Mama/CRC/ Estómago

DTC

1/12 (8,3%); 0/13; 0/8.

Pantel y cols., 1993a

Pulmón

DTC

0/7.

Pantel y cols., 1993b

Mama Mama/CRC/ Estómago

CTC DTC

0. 1/11 (9,1%); 5/12 (41,7%); 4/13 (30,8%).

Müller y cols., 2005 Pantel y cols., 1993a

Pulmón

DTC

3/10 (30%).

Pantel y cols., 1993b

DTC

29/63 (46%) pacientes con DTCs. 4/63 (6,3%) DTCs p53+.

Antigénos asociados a proliferación PCNA

Ki67

p120

Proteínas mutadas Mama/CRC/ Estómago/Pulmón/ p53 Gastrointestinal/ Páncreas

86

Offner y cols., 1999

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Marcador

Tumor

DTC o CTC

Nº de pacientes con CTC/DTC que expresan el marcador (%)

Estudio

Receptores hormonales ER

Mama

DTC

13/107 (12%).

Fehm y cols., 2008

Mama/CRC/ Estómago

DTC

Pantel y cols., 1991

Mama

DTC

9/26 (34,6%); 12/17 (70,6%); 8/11 (72,7%). 16/30 (53,3%).

Schlimok y Riethmüller, 1990

MHC clase I HLA Clase I

Zia y cols., 2001

Receptores de factores de crecimiento Mama/CRC

DTC

10/37 (27%); 4/15 (26,7%).

NSCLC

CTC

16/20 (80%).

Mama/CRC/ Estómago

DTC

48/71 (67,6%); 14/50 (28,0%).

Mama

DTC

20/46 (43%).

Mama

CTC

122/225 (50%) CK+. Fehm y cols., 2010 50/122 (41%) HER2+.

Mama

CTC

Mama

DTC

90/229 (39%) MUC1+, EpCAM+. 42/90 (47%) HER2+. 17/59 (28,8%).

Pulmón NSCLC

DTC

0.

EGFR

HER2

Receptor de transferrina

Punnoose y cols., 2010 Pantel y cols., 1993a

Solomayer y cols., 2006

Fehm y cols., 2010

Schlimok y Riethmüller, 1990 Pantel y cols., 1993b

Proteasas o proteínas asociadas a las proteasas

EMMPRIN

Mama

DTC

11/31 (35%) CK+, con 38 DTC 34/38 (89%) EMMPRIN+.

Reimers y cols., 2004

Colon/Gástrico

DTC

Buergy y cols., 2009

Gástrico

DTC

11/38 (28,94%) CK+, el 16% de las DTC EMMPRIN+; 4/13 (30,76%), el 48,5% de las DTC EMMPRIN+. 81/156 (51,92%).

Próstata

DTC CTC

28/47 (60%); 9/47(19%).

uPAR

Heiss y cols., 2002 Thomas y cols., 2009

87

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

DTC o CTC

Nº de pacientes con CTC/DTC que expresan el marcador (%)

Mama

DTC

36/157 (23%).

Fehm y cols., 2006

Próstata

CTC

10/10 (100%) Todos los pacientes CTC M30+. 24 muestras con 765 CTC.

Larson y cols., 2004

Próstata

CTC

590/765 (77,12%) CTC M30-. 175/ 765 (22,87%) CTC M30+.

Swennenhuis y cols., 2009

Marcador

Tumor

Estudio

Marcadores de apoptosis

M30

Marcadores de células tumorales totipotenciales +

CD44 CD24

Mama

DTC

ALDH1

Mama

CTC

47 pacientes CK+. 141/218 DTC (65%) + CD44 /CD24 69/226 (31% muestras) EpCAM+, MUC1+, HER2+. 69% fueron ALDH1+.

Balic y cols., 2006

Aktas y cols., 2009

Marcadores de EMT

Twist1, Akt2 y/o PI3Kα

Mama

CTC

69/226 (31% muestras) EpCAM+, MUC1+, HER2+. 62% fueron Aktas y cols., 2009 EMT+: 42% Twist1+; 62% Akt2+; y 58% PI3Kα+.

ALDH1 = Proteína aldehído deshidrogenasa; Akt2 = Proteína quinasa B de serina/treonina; CD24 = Sialoglicoproteína de superficie que se expresa en granulocitos maduros y células B, molécula de diferenciación de grupo 24; CD44 = Glicoproteína de superficie envuelta en las interacciones célulacélula, adhesión y migración celular, molécula de diferenciación de grupo 44; CD45 = Antígeno leucocitario común o molécula de diferenciación de grupo 45; CK = Citoqueratina; CRC = Cáncer colorrectal; CTC = Células tumorales circulantes; DTC = Células tumorales diseminadas; EGFR = Receptor del factor de crecimiento epidérmico humano; EMMPRIN = Molécula de adhesión celular inductora de metaloproteasas de matriz extracelular; EpCAM = Molécula de adhesión celular epitelial; ER = Receptor de estrógenos; HLA = Antígeno leucocitario humano; ICAM-1 = Molécula 1 de adhesión intercelular; HER2 = Receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano; Ki67 = Antígeno Ki67 o proteína nuclear de proliferación celular; p120 = Catenina delta 1, proteína asociada a cadherina; p53 = Proteína tumoral de 53 KDa; M30 = Péptido derivado de la rotura de la CK18 durante la apoptosis; MHC = Complejo mayor de histocompatibilidad; NSCLC = Carcinoma de pulmón de células no pequeñas; PCNA = Antígeno nuclear de células en proliferación; PI3Kα = Polipéptido alfa del enzima quinasa 3 fosfatilinositol; PSA = Antígeno específico de próstata; uPAR = Receptor del activador del plasminógeno tipo uroquinasa; Twist1 = Factor de transcripción 1.

88

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

3.5.3. Características genéticas Algunas de las anomalías genéticas que se han detectado en las CTCs y las DTCs de tumores de origen epitelial son (Tabla 4): 1. Acumulación de desequilibrios genómicos, donde lo más general es la ganancia de cromosomas. Müller y cols. (1996) describieron, por primera vez, aberraciones en el número de copias del cromosoma 17 en las DTCs (células CK+) aisladas de aspirados de médula ósea de 9 pacientes con cáncer de mama. Sus resultados mostraron que las DTCs eran aneusómicas; y que en las DTCs individuales era más común que aparecieran monosomías y disomías, y en los cluster de DTCs polisomías. Fehm y cols. (2002) fueron los primeros autores en describir la presencia de aneusomías cromosómicas en las CTCs aisladas de sangre periférica de 31 pacientes con diferentes tipos de tumores (cáncer de mama, colon, pulmón, próstata y riñón). En 20 de los 31 pacientes aparecen más de una CTC, y las aneusomías que presentan para los cromosomas 1, 3, 4, 7, 8, 11 y 17 son en algunos casos (6/20) homogéneas y en otros (8/20) heterogéneas. Posteriormente, realizaron dos estudios más: (i) analizaron el cambio del número de cromosomas (cromosomas 1, 7, 8 y 17) en las CTCs aisladas en 20 pacientes con cáncer de mama, y sus resultados mostraron como la mayoría de las CTCs eran aneusómicas, al menos para uno de los cromosomas estudiados, y es más común la ganancia (44%; 64%; 75%; y 45%, respectivamente) que la pérdida de cromosomas (cromosomas 1, 8 y 17; 8%-15% monosomías, no aparece monosomía para el cromosoma 7); (ii) analizaron si los resultados de las CTCs aisladas en 17 pacientes concordaban con los obtenidos en el tumor primario de estos, y excluyendo 4 pacientes que presentaban CTCs disómicas, la concordancia fue del 76,9% (10/13). Estudios posteriores demuestran que

89

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

las CTCs y DTCs, en su mayoría, son aneusómicas y es más común la ganancia que la pérdida de cromosomas [Swennenhuis y cols., 2009; Klein y cols., 2002; Meng y cols., 2004b]. 2. Amplificación de ERBB2, la cual se puede adquirir durante la progresión tumoral en el caso del cáncer de mama [Meng y cols., 2004a]. Müller y cols. (1996) describieron la amplificación de ERBB2 en las DTCs (células CK+) aisladas de aspirados de médula ósea en 2 de los 8 pacientes (25%) con cáncer de mama que analizaron, demostrando así la naturaleza maligna de éstas células tumorales. Meng y cols. (2004a) detectaron en 9 de 24 pacientes con cáncer de mama, CTCs que presentaban amplificación del gen ERBB2 mientras que sus tumores primarios no lo hacían, por lo que estas CTCs adquirieron la amplificación del gen durante la progresión tumoral. Además, 4 de estos 9 pacientes fueron tratados con herceptin, lo cual obtuvo una respuesta parcial en 2 pacientes y completa en uno de ellos. 3. Rara aparición de mutaciones en TP53 en las DTCs [Offner y cols., 1999; Klein y cols., 2002]. Klein y cols. (2002) analizaron la aparición de mutaciones en TP53 (exones 4-9) en las DTCs de 525 muestras (células CK+ en aspirados de médula ósea y sangre, y células EpCAM+ en nódulos linfáticos) de 474 pacientes con cáncer de mama (304), próstata (106)

y

gastrointestinal

(115).

Sus

resultados

mostraron

que

independientemente del tipo de tumor y del compartimento estudiado (médula ósea, sangre o nódulos linfáticos), existía una gran divergencia genética sobre todo en el número de desequilibrios cromosómicos, que el gen TP53 raramente aparece mutado en las DTCs, y aunque algunas DTCs albergaban mutaciones en TP53 existía una microheterogeneidad en el genotipo de este gen. Además realizaron una hibridación genómica

90

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

comparativa y comprobaron que las DTCs eran genéticamente muy inestables y heterogenéas, y que la heterogeneidad disminuía notablemente con la aparición de metástasis clínicamente detectables (DTCs de los pacientes M1 eran menos heterogéneas que las DTCs de los pacientes M0). 4. Mutaciones en el codón 12 de K-ras en DTCs. Solakoglu y cols. (2002) analizaron la aparición de esta mutación en las DTCs (células CK+) expandidas in vitro, que habían sido aisladas de los aspirados de médula ósea, de 7 pacientes con cáncer de colon. Sus resultados mostraron una gran heterogeneidad en las células analizadas (15-30 células por paciente): 2 pacientes presentaban esta mutación; 4 presentaban tanto la mutación como el alelo normal del gen; y 1 no presentaba la mutación. 5. Activación de mutaciones en EGFR, las cuales se pueden adquirir durante la progresión tumoral del cáncer de pulmón. Maheswaran y cols. (2008) detectaron en pacientes con cáncer de pulmón resistentes a la terapia con inhibidores tirosin-quinasa, que presentaban en su tumor primario mutaciones primarias de EGFR (deleción del exón 19 y mutación sin sentido L858R) y la mutación T790M con una frecuencia muy baja, CTCs con mutaciones en EGFR, que eran mutaciones primarias y la mutación T790M, e incluso, detectaron CTCs con mutaciones adicionales en EGFR que no aparecían en el tumor primario. Esto sugiere que existe una emergencia de la mutación T790M y de mutaciones adicionales durante la progresión tumoral, después de la quimioterapia, y pueden representar diferentes clones celulares seleccionados durante el tratamiento.

91

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

3.5.4. Otras características 3.5.4.1. Potencial proliferativo Solakoglu y cols. (2002) demostraron como era posible realizar expansiones celulares in vitro de DTCs (células CK+) aisladas de 153 pacientes recién diagnósticados de cáncer (próstata, mama, colon y riñón). En este estudio se realizó un sreening previo de la presencia de DTCs en médula ósea, tras esto se realizó el cultivo de células de médula ósea, de 21 a 102 días, y se detectaron células CK+ viables en el 81% de las cultivos (124 pacientes). Este resultado demuestra que la mayoría de los pacientes poseían DTCs viables en médula ósea en el momento del diagnóstico del tumor; y el potencial proliferativo de las DTCs aisladas en médula ósea. Además, la viabilidad de estas células tumorales resultó ser un factor pronóstico de la enfermedad más fiable que la mera detección de DTCs en médula ósea.

92

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Tabla 4. Características genéticas de las CTCs y las DTCs.

Característica

Tumor

DTC o CTC

Nº de pacientes con CTC/DTC que presentan la característica (%)

Estudio

Amplificación de ERBB2

ERBB2

Mama Próstata

DTC

ERBB2

Mama

CTC

14 pacientes (8 con cáncer de mama y 6 con cáncer de próstata) con DTCs. 2/8 (25%) DTCs con amplificación de ERBB2. 6/6 (100%) no amplificación del gen 24 pacientes, tumor primario ERBB2-. 9/24 (37,5%) CTCs amplificación del gen

Müller y cols., 1996

Meng y cols., 2004a

Mutaciones en TP53 TP53

Pulmón/ Mama/ Próstata/ Colon

TP53

Mama/ Próstata/ Gastrointestinal

DTC

DTC/CTC

DTC alelo normal de p53

Offner y cols., 1999

19/115 (16,52%) DTCs mutación TP53 y 2 (1,7%) DTCs deleción homocigótica. 82% de DTCs no presentaron mutación.

Klein y cols., 2002

27 pacientes con CTC, 23 análisis mutaciones EGFR en sus CTC. 20/23 tumor primario mutaciones en EGFR; todas las CTC portan las mutaciones, la mutación T790M aparece en mayor proporción que en tumor primario, y aparecen nuevas mutaciones. 3/23 sin mutaciones en tumor primario; CTC sin mutaciones.

Maheswaran y cols., (2008)

Mutaciones en EGFR

EGFR

Pulmón

CTC

93

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Característica

Tumor

DTC o CTC

Nº de pacientes con CTC/DTC que presentan la característica (%)

Estudio

Desequilibrios genómicos

Ch17

Ch1, 3, 4, 7, 8, 11 y 17

Mama

Mama/ Próstata/ Colon/ Riñón

DTC

9 pacientes con DTCs. 9/9 (100%) DTCs con aneusomías. Se analizaron 197 DTCs totales: 32,48% < 2 copias; 14,72% con 2 copias; y 52,79% > 2 copias del Ch17.

CTC

31 pacientes con CTCs. 25/31 (80,64%), CTCs con aneusomías.

Ch1, 8 y 17 Ch3 y 11

Mama

CTC

Ch1, 7, 8, 11 y 17

Próstata

CTC

Müller y cols., 1996

Fehm y cols., 2002

36 pacientes con dormancia. 13/36 (36,1%) Meng y cols., 2004b CTCs+, con aneusomías en al menos uno de los cromosomas evaluados. Evaluación de 1.720 CTC de 118 muestras de 59 pacientes. Ch1: ≈8% de CTCs con <2 copias; ≈48% 2 copias; y ≈54% >2 copias. Ch8: 8% de CTCs con <2 Swennenhuis y cols., copias; 38% 2 copias; y 2009 54% >2 copias. Ch11: ≈8% de CTCs con <2 copias; ≈48% 2 copias; y ≈54% >2 copias. Ch17: ≈12% de CTCs con <2 copias; ≈58% 2 copias; y ≈30% >2 copias.

Mutaciones en K-ras 2/7 (28,57%) mutación 4/7 (57,14%) mutación + Solakoglu y cols., K-ras Colon DTC alelo normal 2002 1/7(14,28%) alelo normal Ch1 = Cromosoma 1; Ch3 = Cromosoma 3; Ch4 = Cromosoma 4; Ch7 = Cromosoma 7; Ch8 = Cromosoma 8; Ch17 = Cromosoma 17; EGFR = Gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano; ERBB2 = Gen del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano; K- ras = Gen K-ras; TP53 = Gen TP53.

94

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

6.

Relevancia clínica de la detección de DTCs y CTCs La diseminación de células tumorales desde el tumor primario ocurre

principalmente por dos vías, linfática y hematógena.

3.6.1. Diseminación linfática Para estudiar la diseminación linfática es inevitable el estudio de los nódulos linfáticos del tumor primario, ya sea a través del estudio de ganglios linfáticos completos o del estudio del SLN, y por técnicas inmunológicas [Bilchik y cols., 2007; de Boer y cols., 2009; Balch y cols., 2010] o moleculares [Tsujimoto y cols., 2007; Visser y cols., 2008; Koyanagi y cols., 2008]. La afectación de los ganglios linfáticos se considera un indicador de mal pronóstico en tumores como el cáncer de mama, melanoma y colon [de Boer y cols., 2010; Nicholl y cols., 2011; Bilchik y cols., 2001]. Pero existe un número significativo de pacientes sin afectación ganglionar que desarrollan metástasis en otros órganos, por lo que la fiabilidad de este marcador para predecir la diseminación tumoral no es completa y solo parcial [Braun y cols., 2001a]. Son numerosos los estudios que han demostrado la correlación que existe entre la detección de micrometástasis en nódulos linfáticos y una menor supervivencia o un peor pronóstico de la enfermedad en: cáncer de mama [Reed y cols., 2009; de Boer y cols., 2009], melanoma [Giese

y

cols.,

2005;

Balch

y

cols.,

2010],

cáncer

colorrectal

[Bilchik y cols., 2007; Koyanagi y cols., 2008] y cáncer de próstata [Kurahashi y cols., 2005]. Aunque otros autores señalan que el valor pronóstico recae en la detección de macrometástasis en nódulos linfáticos, y no de micrometástasis o ITCs [Gobardhan y cols., 2011]. En cuanto al valor de las ITCs, tanto como marcador que indica realizar la extirpación de los

95

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

ganglios linfáticos [Greene y cols., 2002] como marcador de un peor pronóstico de la enfermedad [Colleoni y cols., 2005; Querzoli y cols., 2006; Reed y cols., 2009; de Boer y cols., 2009; Gobardhan y cols., 2011], no está claro.

3.6.2. Diseminación hematógena Para analizar la diseminación hematógena debemos analizar las DTCs aisladas en médula ósea y las CTCs aisladas en sangre periférica. Se ha demostrado el papel fundamental que juegan las CTCs y las

DTCs

en la

[Pantel

y

Braenhoff,

diseminación 2004;

metastásica de los carcinomas

Paterlini-Brechot

y

Benali,

2007;

Langley y Fidler, 2011; Ignatiadis y Reinholz, 2011], e incluso en la recurrencia local tras la extirpación del tumor primario debido a la “autosiembra tumoral” [Kim y cols., 2009; Langley y Fidler, 2011]. Además, la identificación de estas células puede ser un indicador importante para la toma de decisión sobre el tratamiento adyuvante que se va a administrar y/o de la continuación del mismo [Meng y cols., 2004a; Ignatiadis y Reinholz, 2011].

3.6.2.1. Detección de DTCs en médula ósea La mayor parte de estudios de detección de DTCs en médula ósea utilizan técnicas inmunológicas [Pantel y cols., 2003], las técnicas moleculares presenta los problemas que se han descrito anteriormente en el apartado Técnicas de detección de CTCs y DTCs: Técnicas moleculares. Aunque algunos estudios comparan ambas metodologías y obtienen resultados similares [Slade y cols., 2005].

96

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

La detección de micrometástasis o DTCs en médula ósea proporciona información

adicional

al

tumor

primario

sobre

la

enfermedad

[Pantel y Braun, 2001], y ha demostrado su valor como marcador de mal pronóstico, tanto sobre la supervivencia como el tiempo libre de enfermedad, [Braun

y

en cols.,

diversos 2000;

tumores

Naume

y

como: cols.,

cáncer 2004a],

de

mama

cáncer

colon

[Leinung y cols., 2000], cáncer de próstata [Weckermann y cols., 2001; Lilleby y cols., 2003], cáncer de ovario [Braun y cols., 2001b], carcinoma renal [Buchner y cols., 2006] y cáncer pancreático [van Heek y cols., 2001]. Además, la posibilidad de monitorizar o controlar la presencia de las DTCs en médula ósea podría servir como herramienta para evaluar la eficacia de la quimioterapia administrada [Becker y cols., 2006]. La fuerte correlación existente entre la presencia de micrometástasis en médula ósea y una menor supervivencia y tiempo libre de enfermedad (Tabla 5) [Pantel y Otte, 2001], hace que este marcador haya sido propuesto como un marcador pronóstico independiente de la enfermedad. Y en el caso del cáncer de mama se ha propuesto que debería incluirse en la guía de clínica práctica para uso de marcadores tumorales [Harris y cols., 2007].

97

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Tabla 5. Pronóstico de la enfermedad tumoral por la detección de DTCs en médula ósea [Pantel y Otte, 2001]. Tipo de tumor Cáncer de mama

Marcadores

Porcentaje de detección

Valor pronóstico

CK

175/554 (32%)

PFS, OS

CK

199/552 (35%)

PFS, OS*

EMA

89/350 (25%)

PFS, OS

EMA, TAG12, CK 38/100 (38%)

PFS, OS*

CK

18/49 (37%)

PFS*

TAG12

325/727 (43%)

PFS, OS*

Cáncer de ovario

CK

32/108 (30%)

PFS

Cáncer colorrectal

CK18

28/88 (32%)

PFS*

Cáncer gástrico

CK18

34/97 (35%)

PFS

CK18

47/78 (60%)

PFS

CK18

95/180 (53%)

PFS*

Caáncer esofágico

CK

37/90 (41%)

PFS, OS

Cáncer de pulmón (NSCLC)

CK

17/43 (40%)

PFS

CK18

83/139 (60%)

PFS*, OS

CK18

15/39 (39%)

PFS

*Valor pronóstico como parámetro independiente, confirmado a través de análisis multivariable. CK = Citoqueratina; PFS = Tiempo libre de enfermedad; EMA = Antígeno epitelial de membrana; NSCLC = Carcinoma de pulmón de células no pequeñas; OS = Supervivencia global; TAG12 = Glicoproteina 12 asociada a tumor.

98

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

3.6.2.1. Detección de CTCs en sangre periférica El valor pronóstico de la detección de CTCs en sangre periférica por técnicas molecuales es controvertido, debido a que son técnicas que obtienen resultados variables, incluidos falsos positivos y detecciones positivas de los marcadores en voluntarios sanos, y no reproducibles. Sin embargo, la detección de CTCs en sangre periférica por técnicas inmunológicas indica que ésta podría ser un factor pronóstico de la enfermedad: •

En pacientes con cáncer de mama metastásico se ha comprobado que la

detección de CTCs, antes del tratamiento, tiene valor pronóstico sobre la supervivencia y el tiempo libre de enfermedad [Gaforio y cols., 2003; Cristofanilli y cols., 2004; Cristofanilli y cols., 2005; Müller y cols., 2006; Giuliano y cols., 2011]. Además, esta detección ha demostrado tener un valor pronóstico superior al valor de la carga tumoral; el fenotipo de la enfermedad; y los métodos de imagen que se emplean actualmente [Gaforio y cols., 2003; Cristofanilli y cols., 2004; Hayes y cols., 2006; Cristofanilli y cols., 2007; Bidard y cols., 2008a; Giuliano y cols., 2011]. El valor pronóstico de la detección de estas células tumorales en pacientes no metastásicos parece poseer valor predictivo sobre la enfermedad [Gaforio y cols., 2003; Wülfing y cols., 2006; Bidard y cols., 2010] pero hace falta realizar más estudios que ratifiquen su valor. •

En pacientes con cáncer colorrectal metastásico se ha comprobado que

la detección de CTCs, antes del tratamiento, tiene valor pronóstico sobre la suvervivencia y el tiempo libre de enfermedad [Cohen y cols., 2008; Wong y cols., 2009]. Sin embargo, el valor pronóstico de la detección de estas células tumorales en pacientes no metastásicos no está claro y los estudios

99

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

presentan diferencias significativas en sus resultados [Wong y cols., 2009; Wind y cols., 2009; Thorsteisson y cols., 2011]. •

En el caso de pacientes con cáncer metastásico de próstata, esta

detección tiene valor pronóstico sobre la supervivencia [Danila y cols., 2007; Okegawa y cols., 2009; Goodman y cols., 2009]. La detección de CTCs en sangre periférica durante el tratamiento administrado, puede ser una herramienta útil de seguimiento de la enfermedad y de la evaluación de la eficacia de dicho tratamiento [Hayes y cols., 2006; Cohen y cols., 2008; Pierga y cols., 2008; Nolé y cols., 2008; Tewes y cols., 2009; Giuliano y cols., 2011; Goodman y cols., 2011; Pierga y cols., 2012]. Además, varias investigaciones señalan que la detección de CTCs en sangre periférica podría utilizarse como método de estratificación de los pacientes [Cristofanilli y cols., 2007; Dawood y cols., 2008], e incluso para diseñar terapias individualizadas [Meng y cols., 2004a; Fehm y cols., 2007; Cristofanilli y cols., 2005; Fehm y cols., 2007; Fehm y cols., 2010; Giuliano y cols., 2011; Cristofanilli y Mendelsohn, 2006]. El valor pronóstico que tiene la detección de CTCs en sangre periférica (Tabla 6), hace que haya sido propuesto como un marcador pronóstico independiente de la enfermedad. Y en el caso del cáncer de mama, se ha propuesto su inclusión en la guía de clínica práctica para uso de marcadores tumorales [Harris y cols., 2007].

100

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Tabla 6. Pronóstico de la enfermedad tumoral por la detección de CTCs en sangre periférica. Tipo de tumor y estudio

Marcadores aislamiento y detección

Estadio

% de detección

Valor pronóstico

Cáncer de mama Gaforio y cols., 2003

CK7/8-CK7/8

M0, M1

57/92 (62%)

(≥1 CTCs/10ml) PFS*, OS*

Cristofanilli y cols., 2004

EpCAMCK8/18/19

M1

87/177 (49%)

(≥5 CTCs/7,5ml) PFS*, OS*

Cristofanilli y cols., 2005

EpCAMCK8/18/19

M1

43/83 (52%)

(≥5 CTCs/7,5ml) PFS*, OS*

Bidard y cols., 2010

EpCAMCK8/18/19

M0

26/115 (23%)

(≥1 CTCs/7,5ml) PFS*, OS*

Molnar y cols., 2001

CK7/8- panCKs

M0, M1

24/32 (75%)

(≥1 CTCs/20ml)

Cohen y cols., 2008

EpCAMCK8/18/19

M1

111/430 (26%)

(≥3 CTCs/7,5ml) PFS*, OS*

Sastre y cols., 2008

EpCAMCK8/18/19

M0, M1

Wong y cols., 2009

EpCAM-CK20

M0, M1

Wind y cols., 2009

EpCAMCK8/18/19

M0

Thorsteissoon y cols., 2011

EpCAMCK8/18/19

M0, M1

Danila y cols., 2007

EpCAMCK8/18/19

M1

69/120 (57%)

(≥5 CTCs/7,5ml) OS*

Okegawa y cols., 2009

EpCAMCK8/18/19

M1

32/6 (50%)

(≥5 CTCs/7,5ml) OS*

Cáncer colorrectal

34/94 (36%) (≥2 CTCs/7,5ml) 82/132 (62%) 2/31 (7%)

(≥1 CTCs/10ml) PFS*, OS* (≥1 CTCs/7,5ml)

1/20 (5%) (≥2 CTCs/7,5ml)

Cáncer de próstata

*Valor pronóstico como parámetro independiente, confirmado a través de análisis multivariable. CK = Citoqueratina; EpCAM = Molécula de adhesión celular epitelial; M0 = Pacientes que no presentan metástasis a distancia; M1 = Pacientes que presentan metástasis a distancia; PFS = Tiempo libre de enfermedad; OS = Supervivencia global.

La mayor parte de las investigaciones se han centrado en la detección de CTCs y DTCs en pacientes con cáncer de mama, y ha sido en este tipo de tumor donde ha sido posible demostrar que: • Es posible la detección de CTCs en pacientes en dormancia o latencia tumoral. La dormancia o latencia tumoral es el periodo de tiempo, el cual

101

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

puede ser desde años a décadas, que transcurre desde que un paciente con cáncer se considera curado hasta que aparece la enfermedad metástasica. Es un periodo de restricción del crecimiento tumoral, en el cual existe una enfermedad

residual

presente

pero

se

mantiene

asintomática

[Aguirre-Ghiso, 2007; Willis y cols., 2010]. Meng y cols. (2004b) demostraron la presencia de CTCs en sangre periférica de 36 pacientes con cáncer de mama que no presentaban evidencia clínica de la enfermedad tras 7-22 años de haber sido sometidos a mastectomía. Y concluyeron que, debido a que las CTCs tienen una vida media corta, debe existir un equilibrio entre replicación y muerte celular durante el tiempo de letargo tumoral, y este puede ser uno de los mecanismos que permite la latencia tumoral; • La información que proporcionan CTCs y DTCs, con una concordancia en los

mismos

pacientes del 7,9%

al 93%

[Pierga y

cols.,

2004;

Fehm y cols., 2009; Krishnamurthy y cols., 2010], es diferente según: (i) el compartimento donde se localizan estas células tumorales [Fehm y cols., 2009; Krishnamurthy y cols., 2010]. Fehm y cols. (2009) evaluaron la detección de CTCs en 431 pacientes con cáncer de mama en estadio M0, con el sistema AdnaTest (células EpCAM+, MUC1+ y HER2+), y la detección de DTCs en 414 de estos pacientes, por ICC (células CK+). Sus resultados mostraron una concordancia muy débil entre la presencia de CTCs y DTCs, lo que indica que su significado clínico debe ser diferente; además, las CTCs fueron aisladas, principalmente, en pacientes con tumores triple negativo (ER-, PgR- y HER2-), por lo que la biología del tumor primario parece dirigir la diseminación de las CTCs; (ii) el tipo de pacientes de estudio (metastásicos y no metastásicos), por ejemplo: la detección de DTCs parece que no tiene un interés clínico en pacientes con cáncer de mama metastásico, sin embargo, la detección de estas células tumorales en pacientes no metastásicos tiene valor pronóstico [Bidard y cols., 2008a;

102

Introducción Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Bidard y cols., 2008b]. Por otro lado, la detección de CTCs demuestra tener valor pronóstico y predictivo en pacientes metastásicos [Pierga y cols., 2004; Bidard y cols., 2008a], mientras que en pacientes en estadios tempranos, aunque parece predecir la recaida de la enfermedad durante el tratamiento [Pierga y cols., 2008], sería necesario realizar más estudios para ratificar su valor clínico [Bidard y cols., 2010].

103

HIPÓTESIS DE TRABAJO

Hipótesis Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Las hipótesis de trabajo desde las que se partieron fueron: I.

La detección de las células tumorales circulantes en sangre periférica de pacientes diagnosticados con tumores sólidos epiteliales, tiene valor predictivo en la progresión de la enfermedad y la supervivencia global de estos pacientes.

II.

El análisis individualizado, genético y fenotípico, de las células tumorales circulantes aisladas en sangre periférica de pacientes con tumores sólidos epiteliales, nos da información útil del proceso metastásico.

107

OBJETIVOS

Objetivos Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Los objetivos que se establecieron para esta tesis fueron: I.

Poner a punto una metodología que nos permita de forma individual: detectar, cuantificar y caracterizar, genética y fenotípicamente, las células tumorales circulantes en sangre periférica de pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

II.

Demostrar la utilidad pronóstica de: i)

La cuantificación de las células tumorales circulantes en sangre periférica de pacientes diagnosticados con tumores sólidos epiteliales.

ii)

La evaluación genética y fenotípica de estas células tumorales circulantes en el desarrollo del tumor.

111

TRABAJO EXPERIMENTAL Y RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Capítulo 1 Desarrollo de una técnica de aislamiento y cuantificación de células tumorales circulantes (CTCs) en sangre periférica Detección de CTCs en sangre periférica de pacientes diagnosticadas con cáncer de mama Análisis del valor pronóstico de este nuevo marcador Trabajo publicado en 2003, con título “Detection of breast cancer cells in the peripheral blood is positively correlated with estrogen-receptor status and predicts for poor prognosis”, en la revista International Journal of Cancer. - Índice de impacto de la revista = 4,926 - Categoría a la que pertenece: Oncología - Cuartil que ocupa: primer cuartil

- Rango en la categoría (2010): 32/185. 115

Publication of the International Union Against Cancer

Int. J. Cancer: 107, 984 –990 (2003) © 2003 Wiley-Liss, Inc.

DETECTION OF BREAST CANCER CELLS IN THE PERIPHERAL BLOOD IS POSITIVELY CORRELATED WITH ESTROGEN-RECEPTOR STATUS AND PREDICTS FOR POOR PROGNOSIS Jose´-Juan GAFORIO1*, Marı´a-Jose´ SERRANO1, Pedro SANCHEZ-ROVIRA2, Antonio SIRVENT1, Miguel DELGADO-RODRIGUEZ1, Marı´a CAMPOS1, Nicola´s DE LA TORRE1, Ignacio ALGARRA1, Rosario DUEN˜ AS2, and Ana LOZANO2 1 Department of Health Sciences, Faculty of Experimental Sciences, University of Jae´n, Jae´n, Spain 2 Medical Oncology Department, University Hospital, Jae´n, Spain We investigated whether detection of cytokeratin-positive (CKⴙ) cells in the peripheral blood (PB) of breast cancer patients before chemotherapy could be a prognostic factor. Blood from a total of 92 breast cancer patients was evaluated for the presence of CKⴙ cells. Blood samples were collected before chemotherapy. Patients entered in the study included: neoadjuvant (n ⴝ 25), adjuvant (n ⴝ 42) and metastatic (n ⴝ 25). Blood samples (10 ml) were centrifuged using a double density-gradient to recovering the mononuclear cell (MNC) and granulocyte cell (GC) fractions. Subsequently, positive immunomagnetic cell separation was carried out to isolating CKⴙ cells. The enriched cell fraction was cytocentrifuged and then immunocytochemically labeled using an anti-cytokeratin antibody. Our results indicated that breast tumor cells sediment with both MNC and GC fractions. We therefore recommend examination of both fractions in all enrichment protocols. CKⴙ cells in PB were identified in 57 of 92 (62%) patients when MNC and GC fractions were assessed (range ⴝ 1– 61 cells, median ⴝ 8). No CKⴙ cells were detected in blood samples of 16 healthy donors. There were significant differences in the presence of CKⴙ cells according to estrogen receptor expression (p ⴝ 0.049), and lymph node status (p ⴝ 0.033), but not to the age, menopausal status, type of patient (neoadjuvant, adjuvant or metastatic), TNM stage, histological type, progesterone receptor expression, c-erbB2 expression, p53 expression or Ki67 expression. Regarding the relationship between tumor size (T) and the presence of CKⴙ cells, a borderline significant trend was observed (p ⴝ 0.07). The median follow-up of the patients was 21 months and statistical analysis (Kaplan-Meier analysis) showed that using the method we present, the detection of CKⴙ cells in PB before starting the chemotherapy in breast cancer patients was significantly correlated with both progression-free survival (p ⴝ 0.058) and overall survival (p ⴝ 0.003). In conclusion, the present study suggests that detection of CKⴙ cells in PB before chemotherapy might identify breast cancer patients with poor prognosis. © 2003 Wiley-Liss, Inc. Key words: breast cancer; cytokeratin; magnetic cell sorting; circulating tumor cells; estrogen receptor; prognosis

Breast cancers have been shown to shed tumor cells into the circulation at the earliest stages of primary tumor development. It is accepted that it is the early hematogenous dissemination of the tumor that decides the patient’s fate. Fehm et al.1 have reported that circulating epithelial cells in breast cancer patients are malignant. The potential of circulating tumor cells to form metastases in vivo has been reported by Pretlow et al.2 They showed the capacity to induce metastases in nude mice from tumor cells taken directly from the peripheral blood (PB) of patients. Thus, the early detection of circulating tumor cells may have important therapeutic and prognostic implications. It could be an independent prognostic factor that could identify the patients who are most likely to benefit from adjuvant therapy. Immunological and molecular methods have been used for detecting circulating tumor cells,3 but it has not been possible to standardize a method internationally. This could explain the contradictory results obtained by different groups. We investigated whether detection of cytokeratin-positive (CK⫹) cells in PB of breast cancer patients before chemotherapy

could be a prognostic factor. Cytokeratin is a valuable marker for breast tumor cell in PB. Blood from a total of 92 breast cancer patients was evaluated for the presence of CK⫹ cells. Blood samples were collected before chemotherapy just when the patients were included in this study. Patients entered in the study included: neoadjuvant (n ⫽ 25), adjuvant (n ⫽ 42) and metastatic (n ⫽ 25). Correlation of CK⫹ cells with patient characteristics and with well established prognostic parameters were carried out. We have used an immunomagnetic separation procedure for the detection of circulating tumor cells based on the magnetic cell sorting technique. As a first step, blood samples were centrifuged using a double density-gradient to recovering the mononuclear cell (MNC) and granulocyte cell (GC) fractions. Subsequently, immunomagnetic enrichment technique was carried out to isolating CK⫹ cells before immunocytochemistry using microbeads conjugated with a cytokeratin-specific antibody. Our present results indicate that the detection of CK⫹ cells in PB in breast cancer patients before starting the chemotherapy was (i) associated with short survival and (ii) positively correlated with estrogen receptor status.

MATERIAL AND METHODS

Tumor cell lines The breast carcinoma cell lines MDA-MB-231, MCF-7 and T47D were obtained from the American Type Culture Collection (Rockville, MD). All cells were grown as monolayers in RPMI 1640 medium, supplemented with 2 mM L-glutamine, 10% heatinactivated FBS and a 1% penicillin-streptomycin mixture at 37°C in a 5% CO2 environment. Cells were grown to confluence and passaged with the use of EDTA. Cells in the exponential growth phase were used for all experiments.

Abbreviations: CK, cytokeratin; EDTA, ethylene-diaminetetra acetic acid; ER, estrogen receptor; FITC, fluorescein isothiocyanate; GC, granulocyte cell; MAbs, monoclonal antibodies; MACS, magnetic cell sorting; MNC, mononuclear cell; OS, overall survival; PB, peripheral blood; PBS, phosphate-buffered saline; PFS, progression free survival; PR, progesterone receptor. Grant sponsor: Ministerio de Sanidad y Consumo; Grant number: FIS 02/1879; Grant sponsor: COFIMAN S.L. *Correspondence to: Department of Health Sciences, Faculty of Experimental Sciences (Edif. 5), University of Ja´en, Campus Las Lagunillas s/n, 23071 Ja´en, Spain. Fax: ⫹34-953-012-141. E-mail: [email protected] Received 4 March 2003; Revised 6 June 2003, 7 July 2003; Accepted 15 July 2003 DOI 10.1002/ijc.11479

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CIRCULATING BREAST TUMOR CELLS

Patients and histologic examination The studied group was comprised of 92 breast cancer patients who had been treated consecutively at the Medical Oncology Department (University Hospital, Jae´n, Spain) over the period from April 2000 to December 2002. All patients were followed up until death or until February 1, 2003. Follow-up of the patients was routinely carried out every 6 months and included recording of the development of local and distant tumor relapse and the survival state of the patients. The patients’ ages ranged between 26 –77 years (median ⫽ 55 years). Characteristics of breast cancer patients included in this study are shown in Table I. The type of patient entered in the study included: neoadjuvant (n ⫽ 25), adjuvant (n ⫽ 42) and metastatic (n ⫽ 25). The tumor types of patients were classified by pathologists according to the World Health Organization scheme for typing breast tumors. Immunostaining of primary tumor samples was assessed by Department of Pathology (University Hospital of Jae´n) on routinely processed paraffin sections using the antigen-retrieval method. Sections were examined with monoclonal antibodies (MAbs) recognizing estro-

gen receptor (ER) (clone: 6F11, Master Diagnostica, Granada, Spain); progesterone receptor (PR) (clone: hPRa2⫹hPRa3, Master Diagnostica); c-erbB2 (clone: CB11, Master Diagnostica); p53 (clone: DO7, Master Diagnostica) and; Ki-67 (clone: MIB-1, Dako, Glostrup, Denmark). Steroid hormone receptor status was determined in paraffin-embedded tissue (using immunoperoxidase staining with monoclonal antibodies) and an ER positivity cut-off level of ⬎10% stained nuclei. Blood samples We analyzed the blood of 92 patients with breast cancer from the University Hospital of Jae´n (Spain). With previous informed consent of patients, peripheral venous blood samples (10 ml) were collected in heparinized tubes and processed within 4 hr of collection. Blood samples from neoadjuvant patients were obtained before chemotherapy. Blood samples from adjuvant patients were obtained at least 4 weeks after the patient had undergone primary surgery just before chemotherapy. Metastatic patients (19 of 25) were out-patients returning for follow-up and they had not re-

TABLE I – RELATIONSHIP BETWEEN PATIENT CHARACTERISTICS AND BIOMARKERS WITH DETECTION OF CK-POSITIVE CELLS IN PERIPHERAL BLOOD Patient characteristics and biomarkers

Number of patients Age (years) ⱕ50 ⬎50 Menopausal status Premenopausal Postmenopausal Type of patient Neoadjuvant Adjuvant Metastatic T (tumour size) T1 T2 T3 T4 Tx N (lymph node status) N0 N⫹ Nx M (distant metastasis) M0 M1 Mx TNM stage I II III IV Histological type Ductal Lobular Other ER (estrogen receptor) ⫹ ⫺ PR (progesterone receptor) ⫹ ⫺ cerbB-2 ⫹ ⫺ p53 ⫹ ⫺ Ki67 ⫹ ⫺ 1

Statistically significant.

Patients with CK-positive cells n (%)

Patients with no CK-positive cells n (%)

57 (62.0)

35 (38.0)

21 (63.6) 36 (61.0)

12 (36.4) 23 (39.0)

22 (57.9) 35 (64.8)

16 (42.1) 19 (35.2)

17 (68.0) 24 (57.1) 16 (64.0)

8 (32.0) 18 (42.9) 9 (36.0)

9 (50.0) 27 (62.8) 5 (62.5) 13 (76.5) 3 (50.0)

9 (50.0) 16 (37.2) 3 (37.5) 4 (23.5) 3 (50.0)

5 (33.3) 47 (69.1) 5 (55.6)

10 (66.7) 21 (30.9) 4 (44.4)

34 (61.8) 16 (64.0) 7 (58.3)

21 (38.2) 9 (36.0) 5 (41.7)

2 (33.3) 25 (64.1) 14 (63.6) 16 (64.0)

4 (66.7) 14 (35.9) 8 (36.4) 9 (36.0)

38 (59.4) 9 (69.2) 10 (66.7)

26 (40.6) 4 (30.8) 5 (33.3)

40 (69.0) 11 (44.0)

18 (31.0) 14 (56.0)

34 (63.0) 13 (52.0)

20 (37.0) 12 (48.0)

40 (61.5) 8 (61.5)

25 (38.5) 5 (38.5)

22 (66.7) 27 (62.8)

11 (33.3) 16 (37.2)

29 (59.2) 5 (62.5)

20 (40.8) 3 (37.5)

p-value

0.827 0.521 0.679

0.07

0.0331

1.000

0.543

0.802

0.0491 0.461 1.000 0.559 0.897

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GAFORIO ET AL.

ceived any treatment (chemotherapy, surgery, radiotherapy or hormonotherapy) for at least 24 weeks before blood collection. Six of 25 of these patients were diagnosed as metastatic at the time to enter in the protocol of study, thus these patients had not received any treatment before blood collection. The study was reviewed and approved by the Ethics Committee of the Hospital. As negative controls, 16 blood samples from healthy volunteers without evidence of an epithelial malignancy were examined. The positive controls were obtained using 10 ml of blood from healthy volunteers spiked with cells from three human breast cancer cell lines (MCF-7, MDA-MB-231 or T47D) and processed separately from patient samples, to avoid contamination. Density gradient separation According to the Sigma procedure, a double gradient was formed by layering 5 ml of HISTOPAQUE-1077 (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) over an equal volume of HISTOPAQUE1119 (Sigma). Blood samples were carefully layered onto the upper HISTOPAQUE-1077 medium. The tubes were then centrifuged at 700g for 30 min. The GC fraction was found at the 1077/1119 interphase whereas the MNC fraction was found at the plasma/1077 interphase. Both cell fractions were mixed and washed in 50 ml PBS. Magnetic labeling Cells were then magnetically labeled according to the manufacturer protocols (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Cytokeratin-expressing cells from peripheral blood of breast cancer patients were enriched and detected using the Carcinoma Cell Enrichment and Detection Kit, Immunocytochemistry (Miltenyi Biotec). Briefly, cells were permeabilized with MACS CellPerm Solution in a volume of 45 ml for 5 min at 20 –25°C and fixed upon addition of 5 ml of MACS CellFix Solution for 30 min at 20 – 25°C. The cells were then washed twice in 1⫻ MACS CellStain Solution and resuspended in 600 ␮l of the same solution. To block Fc receptors, 200 ␮l of FcR Blocking Reagent were added, and tumor cells were magnetically labeled by adding 200 ␮l of MACS Cytokeratin MicroBeads (colloidal super-paramagnetic MicroBeads conjugated to a monoclonal anti-cytokeratin 7/8 antibody; Clone: CAM5.2) and incubating the cells for 45 min at 20 –25°C. After incubation, cells were stained with 100 ␮l of anti-cytokeratin conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) for 10 min in the dark at 20 –25°C. After washing, cells were resuspended in a final volume of 500 ␮l CellStain Solution and stained with 10 ␮l of anti-FITC conjugated to alkaline phosphatase for 10 min in the dark at 20 –25°C. Magnetic cell separation For magnetic enrichment of epithelial tumor cells, the magnetically labeled cell suspension was applied to a prefilled positive separation column (MiniMACS separation columns, type MS⫹) in the magnetic field of a MiniMACS separator (Miltenyi Biotec). The cells were passed through the column and washed three times with 500 ␮l dilution buffer, so negative (non-magnetic) cell population was washed out of the column. Afterward, the column was removed from the gradient magnetic field and the retained cells were collected (magnetic-positive cell population) as elute using the plunger after a dilution buffer washing step with a total volume of 1 ml. Sample preparation and detection of epithelial tumor cells by immunocytochemistry The magnetically enriched cell fractions were spun down onto polylysine-coated glass slides (Sigma) in a cytocentrifuge (Hettich, Tuttlingen, Germany) at 1,500 rpm for 10 min. Slides were airdried overnight at room temperature. The slides were washed in PBS, and cytokeratin-expressing cells were revealed by incubation with freshly prepared Fast Red TR/Naphthol AS-MX substrate solution for 15 minutes in humidity chamber at room temperature. Slides were washed once with PBS and stained with Mayer’s

haematoxylin solution (Sigma) for 30 sec at room temperature. Slides were then washed once with double distilled water, and air-dried. Finally, slides were mounted with Kaiser’s glycerol gelatin (Merck, Darmstadt, Germany) for the permanent record. The cytospins were evaluated by light microscopy, and CK⫹ cells were counted by 2 researchers with experience in the determination of tumor cells. The cytospin slides were examined in a blinded fashion. All positive cells evaluated as CK⫹, showed a strong cytoplasmic staining pattern, and the cytomorphology was consistent with a malignant cell. Analysis of recovery experiments by immunocytochemistry Venous blood (10 ml) from healthy volunteers were spiked with varying numbers of tumor cells (3,000, 1,000, 500, 50 cells) from 3 human breast cancer cell lines (MCF-7, MDA-MB-231 or T47D). To detect epithelial tumor cells, each one of the fractions were separately processed as described above. After immunomagnetic enrichment of tumor cells, CK⫹ cells were detected by immunocytochemistry (as described above). Analysis of recovery experiments by flow cytometry Venous blood (5 ml) from healthy volunteers were spiked with varying numbers of tumor cells (3,000, 1,000 cells) from 2 human breast cancer cell lines (MCF-7 or MDA-MB-231). A double gradient was formed by layering 2.5 ml of HISTOPAQUE-1077 over an equal volume of HISTOPAQUE-1119. Spiked blood samples were carefully layered onto the upper HISTOPAQUE-1077 medium. The tubes were then centrifuged at 700g for 30 min. Each one of the fractions (MNC and GC) were separately processed, washed in 50 ml PBS and then stained for 20 minutes at 4°C with 10 ␮l of Quantum Red conjugated anti-human CD45 (clone: BRA-55, Sigma) and 10 ␮l of FITC-conjugated anti-human epithelial antigen Ber-EP4 MAbs (clone: Ber-EP4, Dako). After incubation, cells were harvested by centrifugation (at 100g and 4°C for 10 min), washed twice in cold PBS supplemented with 2% FCS and 0.1% sodium azide, and finally resuspended in 500 ␮l of a 2% paraformaldehyde solution. Samples were analyzed by flow cytometry on an EPICS Elite ESP flow cytometer (Coulter, Hialeah, Florida). Flow cytometry histograms were generated by logarithmic amplification of fluorescence emitted by single viable cells. Cells labeled with appropriated isotypes control were included as control. Statistical analysis The patient characteristics were related to the presence of CK⫹ cells in PB by using Fisher’s exact test. When a variable was ordered a trend analysis was applied. Actuarial curves for progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) were calculated by the Kaplan-Meier method. PFS and OS were calculated from the date of the primary detection of CK⫹ cells in PB to the date of disease progression or death. Disease progression was defined as both metastatic recurrence of nonmetastatic patients and progression of metastatic patients. All statistical calculations were carried out using the STATA 7-SE (Stata Inc., College Station, Texas, USA) Analysis Program. The cut-off point for significance was taken as p ⫽ 0.05. RESULTS

Improvement of the yield of circulating tumor cells enrichment using a double density-gradient centrifugation As a first step, we evaluated whether breast tumor cells sediment preferentially with MNC or GC fraction. Peripheral blood from healthy volunteers were spiked with varying numbers of tumor cells (3,000, 1,000, 500, 50 cells) from 3 human breast cancer cell lines (MCF-7, MDA-MB-231 or T47D). The spiked blood were centrifuged using a double density-gradient (HISTOPAQUE-1119 and -1077) to recovering the MNC and GC fractions. Each one of the fractions were separately processed to isolating CK⫹ cells. After immunomagnetic enrichment of tumor cells, CK⫹ cells were detected by immunocytochemistry (Fig. 1a). The majority of tu-

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CIRCULATING BREAST TUMOR CELLS

FIGURE 1 – CK⫹ cells (blue arrows) detected by immunocytochemistry. (a) Blood from a healthy volunteer spiked with MDA-MB-231 tumor cells. (b,c) Peripheral blood of 2 breast cancer patients. Invariably, cell fractions were processed for a positive immunomagnetic tumor cells separation and finally immunocytochemically labeled using the cytokeratin 7/8 antibody CAM5.2. CK⫹ cells show a strong cytoplasmic staining pattern, and the surrounding hematopoietic cells show no expression of cytokeratins. Total recovery rates using a double density-gradient and positive immunomagnetic enrichment of tumor cells in spiking experiments were in the range of 60 – 80%.

mor cells were observed to sediment with the MNC fraction (Fig. 2). Invariably, however, tumor cells were also detected in the GC fraction. To confirm that tumor cells appear in GC fraction we carried out another experiment. PB from healthy volunteers were spiked with varying numbers of tumor cells (3,000, 1,000 cells) from 2 human breast cancer cell lines (MCF-7 or MDA-MB-231). The spiked blood were centrifuged using a double density-gradient (HISTOPAQUE-1119 and -1077) to recovering the MNC and GC fractions. Each one of the fractions (MNC and GC) were separately processed, and then labeled with anti-human CD45 and anti-human epithelial antigen Ber-EP4 MAbs. Finally, samples were analyzed by flow cytometry. The antibody Ber-EP4 reacts with two glycopeptides (MW 34000 and 39000) expressed in breast tumor cells, but not in hematopoietic cells. CD45 mAb reacts with the hematopoietic cells, but not with the breast tumor cells. Thus, tumor cells were detected as Ber-EP4 positive and

FIGURE 2 – Tumor cells recovery from (a) MNC and (b) GC leukocyte fractions after spiking blood from healthy volunteers with 3,000, 1,000, 500 and 50 tumor cells. Each one of the fractions were separately processed. After immunomagnetic enrichment, tumor cells were detected by immunocytochemistry. The results are the means of triplicate experiments. The mean and range of tumor cells recovered are shown.

TABLE II – FLOW CYTOMETRIC DETECTION OF Ber-EP4-POSITIVE AND CD45-NEGATIVE CELLS IN THE RECOVERY EXPERIMENT1 MCF7 cells spiked in 5 ml of PB (n)

Recovery of tumour cells in MNC fraction (%) Recovery of tumour cells in GC fraction (%) 1

MDA-MB-231 cells spiked in 5 ml of PB (n)

3000

1000

3000

1000

47

49

53

55

6

5

7

6

Results are the means of triplicate experiments.

CD45 negative cells. The majority of tumor cells were observed to sediment with the MNC fraction however, tumor cells were also detected in the GC fraction (Table II).

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GAFORIO ET AL.

FIGURE 3 – Kaplan-Meier plot for progression-free survival (PFS) in 26 patients depending on the detection of CK-positive cells. There were 6 patients in the CK-negative group (dashed line) and 20 patients in the CK-positive group (solid line). PFS was calculated from the date of the primary detection of CK-positive cells in peripheral blood to the date of disease progression.

Efficacy and specificity of the method Recovery rates using a double density-gradient (HISTOPAQUE-1119 and -1077) and positive immunomagnetic enrichment of tumor cells in our spiking experiments were in the range of 60 – 80% in calculations based on the total number of cells. Detection of CK⫹ cells by immunocytochemistry was carried out as described above. We could not detect CK-expressing cells in any of the samples from 16 healthy donors. Correlation of CK⫹ cells in PB with clinic-pathological features CK⫹ cells detected by immunocytochemistry in the PB of breast cancer patients show a strong cytoplasmic staining pattern, and the surrounding hematopoietic cells show no expression of cytokeratins (Fig. 1b,c). Correlation of CK⫹ cells in PB with patient characteristics are outlined in Table I. p-Values are based on Fisher’s exact test for association for ordinal variables and ␹2 test for trend was applied. A total of 92 breast cancer patients were studied. Patient types entered in the study included: neoadjuvant (n ⫽ 25), adjuvant (n ⫽ 42) and metastatic (n ⫽ 25). The median age of the patients was 55 years (range ⫽ 26 –77 years); 64% of all patients were older than 50 years. Fifty-four patients (59%) had a postmenopausal status. Tumors in Stage T2 were the most common (47%) followed by tumors in Stage T1 (20%). 27% of patients had tumor Stages T3 and T4. The nodal status was positive in 74% of patients. Ductal breast cancer was the most frequent (70%) histological type. CK⫹ cells in PB were identified in 57 of 92 (62%) breast cancer patients with a range of 1– 61 cells (median ⫽ 8). There were significant differences in the presence of CK⫹ cells according to estrogen receptor expression (p ⫽ 0.049), and lymph node status (p ⫽ 0.033), but not to age (p ⫽ 0.827), menopausal status (p ⫽ 0.521), type of patient (p ⫽ 0.679), TNM stage (p ⫽ 0.543), histological type (p ⫽ 0.802), progesterone receptor expression (p ⫽ 0.461), c-erbB2 expression (p ⫽ 1.000), p53 expression (p ⫽ 0.559), or Ki67 expression (p ⫽ 0.897). Regarding the relationship between tumor size and the presence of CK⫹ cells a borderline significant trend was observed (p ⫽ 0.07). Prognostic analysis Kaplan-Meier analysis of the progression free survival and overall survival depending on the detection of CK⫹ cells are presented in Figures 3 and 4, respectively. Follow-up data were taken from the time of the last clinic appointment or the date of

FIGURE 4 – Kaplan-Meier plot for overall survival (OS) in 90 patients depending on the detection of CK-positive cells. There were 34 patients in the CK-negative group (dashed line) and 56 patients in the CK-positive group (solid line). Only tumor-specific death was counted.

death (median follow-up ⫽ 21 months; range ⫽ 2–31 months). Complete follow-up data were available from 90 patients. Statistical analysis (Kaplan-Meier analysis) showed that the primary detection of CK⫹ cells in PB was positively correlated with disease progression (p ⫽ 0.058). A total of 26 patients developed disease progression during follow-up. Twenty of these patients had CK⫹ cells in PB. Most strikingly, the correlation with the survival data showed that, among 92 patients admitted to the study, 11 patients died and all of them had CK⫹ cells in PB. In contrast, all patients without CK⫹ cells are still alive. Likewise, the KaplanMeier survival analysis showed that the presence of CK⫹ cells in PB was associated with short survival (p ⫽ 0.003). DISCUSSION

Some methodological aspects in our study have to be addressed. Our detection method applying immunomagnetic enrichment followed by immunocytochemistry had been standardized previously.7 Immunocytochemistry is a sensitive and specific technique that can be used to identify breast cancer cells in PB.4,8 Cytokeratins are stably expressed and are specific markers of epithelial tumor cells in PB.9,10 Current assays for detecting circulating breast tumor cells are limited primarily by the lack of tumorspecific markers, being cytokeratin one of the most used markers to this end. Cytokeratins are part of the cytoskeleton of epithelial cells and therefore represent a unique feature of epithelial cells; however, constitutive low-level (illegitimate) expression of CK have been reported in peripheral-blood mononuclear cells in healthy controls. This could be the origin of false positive results when circulating tumor cells are detected by RT-PCR. To ensure high specificity of the assay, we have incorporated the following controls and precautions in our study: (i) the positive controls (tumor cell lines-spiked controls) were processed separately from patient samples, to avoid contamination; (ii) the first milliliters of blood collected from the patients were discarded to avoid contamination with squamous cells; (iii) we have used an immunomagnetic enrichment method followed by immunocytochemistry previously standardized7; (iv) Fc receptors from cells were blocked with FcR blocking reagent to avoid unspecific binding previously to the incubation of cells with the anti-Cytokeratin mAb,; and (v) we have used the mAb CAM5.2 (anti-cytokeratin 7/8) for specific magnetic labeling of breast tumor cells. Different independent studies evaluating several MAbs for detection of disseminated tumor cells have demonstrated that the mAb CAM5.2 produces a strong uniform staining of primary carcino-

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mas derived from many organs, including breast.7 Although cytokeratin has been validated as a valuable marker for breast cancer in many clinical studies, it is not a tumor cell-specific marker and could result in weak cytoplasmic staining of some hematological cells. Thus, in our assay, only the cells with a strong uniform cytoplasmic staining were evaluated as CK⫹ cells. The specificity of the assay was confirmed in control healthy volunteers; CKexpressing cells were not detected in any of them. The assay was carried out as blinded study with PB samples from healthy donors and breast cancer patients. PB samples from volunteers and breast cancer patients were obtained at the Hospital and then processed at the Department of Health Sciences (University of Jae´n) without previous inform. The frequency of detection of CK⫹ cells in PB varies among studies.5,8 For a reliable comparison of results, international standardization of detection protocols would be desirable. It is accepted that the method for tumor cell isolation may be critical.9 Cellular loss is estimated to be up to 60% during the various steps that precede microscopic examination.4 As a first step, most enrichment protocols use Ficoll density gradient centrifugation to obtain MNC fraction.9 Our results showed that epithelial tumor cells sediment preferentially with the MNC but also with GC fractions when breast cancer cell lines were used to spike blood from healthy volunteers. Nevertheless, the results from these experimental model may not predict results with clinical specimens. In fact, tumor cells from cultured cell lines are very homogeneous, whereas circulating tumor cells vary widely in size, shape and weight. Therefore, it is reasonable to assume that an important number of tumor cells sediment with GC fraction in clinical samples. In agreement with this hypothesis, Partridge et al.11 reported that tumor cells sediment with GC fraction when they analyzed blood samples obtained from patients with head and neck squamous cell carcinoma. Our data suggest that breast tumor cells may be missed if only MNC fractions are examined. We therefore recommend examination of MNC and GC fractions in all enrichment protocols. In our present study, CK⫹ cells in PB were detected in 62% of breast cancer patients when MNC and GC fractions were assessed. The overall CK⫹ rate reported in the present study is higher those published in previous studies.12,13 Other studies, however, have reported higher or similar percentages of CK⫹ cells in PB then those showed in our present study. Racila et al.14 showed that CK⫹ cells in PB were present in 32 of 33 breast cancer patients using a combination of immunomagnetic enrichment method and flow cytometry. Engel et al.6 evaluated PB specimens from patients with breast and ovarian cancer and detected CK⫹ cells in 35 of 48 patients (72.9%) using a combination of magnetic activated cell sorting (MACS) and fluorescence in situ hybridation (FISH). Molnar et al.15 found circulating tumor cells in 24 of 32 (75%) colorectal cancer patients. These authors use the same procedure (Carcinoma Cell Enrichment Kit; Miltenyi Biotec) that we have used in our study. Martin et al.7 evaluated PB specimens from patients with carcinoma of the breast, prostate, colon, rectum and lung, and detected CK⫹ cells in 21 of 34 patients (61.8%) using the same immunomagnetic enrichment method that we use. It is important to note that the results reported by these authors are very similar to the results showed in the present study (62%). Thus the divergent results reported by the different authors could be due to the diverse methods used to detect CK⫹ cells. We found CK⫹ cells not only in patients with advanced breast cancer tumors (13/17 cases [76.5%] in T4 tumors) but also in 9/18 cases (50%) with a small tumor (T1) (Table I). Our data suggest an association between the presence of CK⫹ cell in PB and lymph node status (p ⫽ 0.033) (Table I). Nevertheless, 5/15 node-negative (N0) patients (33.3%) had detectable CK⫹ cells in the PB. Thus, these findings suggest that the assay could identify early tumor cell dissemination into the peripheral bloodstream. Our data suggest that presence of tumor cells in PB could be an event more

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frequent than expected. On the other hand, we were not able to show any significant correlation between the presence of CK⫹ cell in PB with the biomarkers, cerbB-2, p53 or Ki67 (Table I). It is important to note that 19 of 25 metastatic patients were out-patients returning for follow-up and they had completed their treatment (chemotherapy, surgery, radiotherapy or hormonotherapy) as a minimum 24 weeks before blood collection. Six of 25 of these patients were diagnosed as metastatic at the time to enter in the protocol of study, thus these patients had not received any treatment before blood collection. Most of the published studies have found differences in the detection rates for circulating tumor cells between metastatic and nonmetastatic patients. The fact that a heterogeneous population of metastatic patients were included in the present study (76% of metastatic patients were treated previously and 24% of these one did not) could explain that we have not found significant differences between metastatic and nonmetastatic patients. The detection rates reported in the present study in nonmetastatic patients are higher than many authors have previously reported. Nevertheless, our results suggest that the presence of breast tumor cells in PB could be an event more frequent than expected in nonmetastatic patients. These results are in agreement with those reported by Solakoglu et al.16 that found CK⫹ cells in bone marrow in 78.9% of patients without metastasis (M0). The detection of tumor cells in bone marrow in primary breast cancer is a known prognostic factor for disease-free and overall survival1,17 but, to date, conclusive results have not been reported in PB. We showed that detection of CK⫹ cells in PB before chemotherapy significantly correlated with both progression-free survival and overall survival (Figures 3,4). Therefore, with a median follow-up period of 21 months, detection of CK⫹ cells in PB seems to be predictive of early progression. Interestingly, there was a significant association (p ⫽ 0.049) between presence of CK⫹ cells in PB and ER status of primary tumor when we analyze data obtained from all patients (metastatic and nonmetastatic). Our results suggest that the expression of ER could confer to breast tumor cells some advantage properties, i.e., facilitating tumor cell entry into bloodstream or preventing cell apoptosis. In this context, a recent study18 showed that many but not all endogenous estradiol metabolites elicit a biphasic pattern of proliferation in the receptor-positive breast cancer cell line, i.e., at low concentrations a stimulatory effect and at high concentration an inhibitory effect on cell growth. It has also been shown that estrogen could prevent apoptosis through ER-mediated mechanisms.19 In breast cancer patients, therapeutic decisions should be made using well-accepted prognostic and predictive indicators. Estrogen receptor (ER) status is important for determining the treatment and the prognosis of breast cancer patients. There is a general consensus that patients with ER-positive breast tumors have longer overall survival than patients with ER-negative tumors, but this is restricted partly to specific subgroups.20 –22 Watts et al.23 suggested that overexpression of cyclinD1 in ER-positive tumors may lead to insensitivity of antiestrogens. Costa et al.22 reported that PR seemed to be comparable to ER status in predicting the prognosis of primary breast cancer patients. It is imperative, therefore, to identify newer prognostic and predictive markers that could support treatment decisions for patients with breast cancer. Our results suggest that because tumorigenic and metastatic potential of circulating tumor cells have been demonstrated,1,2 detection of CK⫹ cells in PB seems to be a good indicator of early systemic tumor cell dissemination and could lead to identify a subgroup of breast cancer patients (including patients with ER⫹ breast tumors) with poor prognosis. We conclude that, although larger series and longer follow-up are needed to confirm our results, our present study suggests that detection of CK⫹ cells in PB before chemotherapy might identify breast cancer patients with poor prognosis.

990

GAFORIO ET AL.

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Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Capítulo 2 Desarrollo de una nueva metodología que permite de forma individual realizar el análisis simultáneo del fenotipo y genotipo de las células tumorales circulantes.

Trabajo

publicado

en

2008,

con

título

“Phenotypic

and

genetic

characterization of circulating tumor cells by combining immunomagnetic selection and FICTION techniques”, en la revista Journal of Histochemistry and Cytochemestry. - Índice de impacto de la revista = 2,381 - Categoría a la que pertenece: Bbiología Celular - Cuartil que ocupa: tercer cuartil - Rango en la categoría (2010): 116/178.

125

Volume 56(7): 667–675, 2008 Journal of Histochemistry & Cytochemistry

http://www.jhc.org

ARTICLE

Phenotypic and Genetic Characterization of Circulating Tumor Cells by Combining Immunomagnetic Selection and FICTION Techniques

The Journal of Histochemistry & Cytochemistry

Marı´a Campos, Celia Prior, Fernando Warleta, Isabel Zudaire, Jesu´s Ruı´z-Mora, Rau´l Catena, Alfonso Calvo, and Jose´ J. Gaforio Immunology Division, Department of Health Sciences, Faculty of Experimental Sciences, University of Jae´n, Jae´n, Spain (MC,FW,JR-M,JJG); Division of Oncology, Center for Applied Medical Research (CIMA), Pamplona, Spain (CP,IZ,RC,AC); and Department of Genetics (IZ) and Department of Histology and Pathology (RC,AC), University of Navarra, Pamplona, Spain

The presence of circulating tumor cells (CTCs) in breast cancer patients has been proven to have clinical relevance. Cytogenetic characterization of these cells could have crucial relevance for targeted cancer therapies. We developed a method that combines an immunomagnetic selection of CTCs from peripheral blood with the fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics as a tool for investigation of neoplasm (FICTION) technique. Briefly, peripheral blood (10 ml) from healthy donors was spiked with a predetermined number of human breast cancer cells. Nucleated cells were separated by double density gradient centrifugation of blood samples. Tumor cells (TCs) were immunomagnetically isolated with an anti-cytokeratin antibody and placed onto slides for FICTION analysis. For immunophenotyping and genetic characterization of TCs, a mixture of primary monoclonal anti-pancytokeratin antibodies was used, followed by fluorescent secondary antibodies, and finally hybridized with a TOP2A/HER-2/CEP17 multicolor probe. Our results show that TCs can be efficiently isolated from peripheral blood and characterized by FICTION. Because genetic amplification of TOP2A and ErbB2 (HER-2) in breast cancer correlates with response to anthracyclines and herceptin therapies, respectively, this novel methodology could be useful for a better classification of patients according to the genetic alterations of CTCs and for the application of targeted therapies. (J Histochem Cytochem 56:667–675, 2008)

SUMMARY

BREAST CANCER is the most frequent type of cancer in women (Parkin et al. 2005). Because of its high incidence and good prognosis, breast cancer is the most prevalent cancer in the world today. Approximately 4.4 million women who were diagnosed with breast cancer within the last 5 years are still alive (Parkin et al. 2005). Despite the improvement in detection and treatment, z30% of newly diagnosed women with breast cancer will die. In most cases, death results from the dissemination of cancer cells through lymphatic or blood vessels and the development of distant metastases.

Correspondence to: Jose´ J. Gaforio, PhD, MD, Immunology Division, Department of Health Sciences, Faculty of Experimental Sciences, Campus las Lagunillas, University of Jae´n, 23071 Jae´n, Spain. E-mail: [email protected] Received for publication February 22, 2008; accepted March 27, 2008 [DOI: 10.1369/jhc.2008.951111]. C The Histochemical Society, Inc.

0022-1554/08/$3.30

KEY WORDS breast cancer circulating tumor cells cytokeratin expression FICTION ERBB2 (HER-2/neu) gene immunomagnetic selection TOP2A gene

The ErbB2 oncogene (also known as c-erbB2/HER-2/ neu) is the most frequently amplified oncogene in breast cancer (20–35% of invasive breast tumors) (Pauletti et al. 1996; Press et al. 1997; Ross and Fletcher 1999), which correlates with poor clinical outcome (Ja¨rvinen and Liu 2003). ErbB2 is localized at 17q12-q21 and encodes a 185-kDa tyrosine kinase protein that belongs to the epidermal growth factor (EGF) receptor family. Although there is no known ligand for ErbB2, heterodimerization with other members of the EGF receptor family causes a strong mitotic response (Olayioye et al. 2000; Yarden and Sliwkowski 2001). Patients with ErbB2 gene amplification or protein overexpression are eligible for trastuzumab (Herceptin) therapy. TOP2A, a gene that codes for the protein topoisomerase-IIa, is another key gene for breast cancer. TOP2A is located at the ErbB2 region and has been found altered in almost 90% of primary breast 667

The Journal of Histochemistry & Cytochemistry

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Campos, Prior, Warleta, Zudaire, Ruı´z-Mora, Catena, Calvo, Gaforio

cancers with ErbB2 amplification (Ja¨rvinen et al. 1999, 2000). However, although 40% of those cases have a coamplification of both genes, in another 40% of the tumors, TOP2A has been found deleted (Ja¨rvinen and Liu 2003). Breast cancer cells with high topoisomeraseIIa expression show a better response to anthracyclines (such as doxorubicin, epirubicin, or idarubicin) (Ja¨rvinen and Liu 2003,2006; Hannemann et al. 2006). Therefore, the determination of genomic amplification of either ErbB2 or TOP2A in breast cancer patients is critical for administering an effective targeted therapy. Breast cancer has been shown to shed tumor cells into the circulation, even at the earliest stages of primary tumor development (Gaforio et al. 2003). Pretlow et al. (2000) have shown that circulating tumor cells (CTCs) isolated from peripheral blood (PB) of patients with cancer are able to develop metastasis when xenotransplanted into nude mice. Thus, the early detection of CTCs may have important therapeutic and prognostic implications. The number of CTCs in PB from breast cancer patients has clinical relevance (Gaforio et al. 2003; Cristofanilli et al. 2005; Cristofanilli and Mendelsohn 2006; Mu¨ller et al. 2006; Camara et al. 2007), not just as an indicator of overall survival, but also as a disease progression marker and/or metastatic marker. However, little attention has been paid to the cytogenetic features of such cells. In 1992, Weber-Matthiesen et al. (1992) developed a new technique for simultaneous immunophenotyping and interphase cytogenetics analyses using cell lines. The method was referred to as fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics as a tool for investigation of neoplasm (FICTION). This technique was shown to be very useful in the study of hematological neoplasms (Nylund et al. 1993; Haferlach et al. 1997; Temple et al. 2004; Young et al. 2006). In this study, we show the development of a novel method that combines immunomagnetic selection of tumor cells (TCs) with cytogenetic characterization by FICTION analysis. With this method, we were able to isolate TCs from a 10-ml blood sample, immunophenotype them (with anti-cytokeratin antibodies), and analyze ErbB2, TOP2A, and CEP17 gene copy number.

Materials and Methods Materials

Cell culture media MEM with Earle’s salt and RPMI1640 and fetal calf serum (FCS) were obtained from PAA Laboratories (Pasching, Austria). Penicillinstreptomycin, PBS, formaldehyde 37% solution (formalin), Igepal, Histopaque 1077, Histopaque 1119, poly-L-lysine–coated glass slides, and Fast Red TR/ Naphthol AS-MX substrate were purchased from Sigma (St. Louis, MO). The Carcinoma Cell Enrichment and Detection Kit, the MACS MS Columns, anti-

cytokeratin 7/8 antibody (isotype: mouse IgG2a) conjugated to FITC, and anti-FITC antibody (Isotype: mouse IgG1) conjugated to alkaline phosphatase were obtained from Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany). Mouse anti-human AE1-AE3 antibody was purchased from BioGenex (San Ramon, CA). This is a biclonal mouse antibody cocktail that recognizes cytokeratins 1/2/3/4/5/6/7/8 (clone: AE1; immunoglobulin class: IgG1) and cytokeratins 10/14/15/16/19 (clone: AE3; immunoglobulin class: IgG1). Secondary antibodies Alexa Fluor 350 rabbit anti-mouse IgG (H1L) and Alexa Fluor 350 goat anti-rabbit IgG (H1L) and the Slow Fade Light Antifade Kit were obtained from Invitrogen (Eugene, OR). The LSI TOP2A/HER-2/ CEP17 multicolor probe was purchased from Abbott Molecular (Vysis; Des Plaines, IL). Sodium chloridesodium citrate buffer (SSC) was obtained from MP Biomedicals Europe (Illkirch, France). Methanol, acetone, and ethanol absolute were purchased from Panreac Quimica (Barcelona, Spain). Acetic acid (glacial), Mayer’s hematoxylin, and Kaiser’s glycerol gelatin were obtained from Merck (Darmstadt, Germany). Cell Lines

The human breast cancer cell lines MCF-7 and MDAMB-231, known to have no ErbB2 amplification, were obtained from the American Type Cultured Collection (ATCC; Rockville, MD). SK-Br-3, a human breast cancer cell line with ErbB2 amplification, was obtained from Eucellbank (Barcelona, Spain). MCF-7 and MDAMB-231 cells were grown in MEM with Earle’s salt, supplemented with 10% (v/v) heat-inactivated FCS and 1% of a stock solution of penicillin-streptomycin. SK-Br-3 was grown in RPMI 1640, supplemented with 10% (v/v) heat-inactivated FCS and 1% of a stock solution of penicillin-streptomycin. Cells in the exponential growth phase were used for all experiments. Blood Sample Processing and Density Gradient Separation

PB samples (10 ml) from nine healthy volunteers were obtained in heparinized tubes (BD Vacutainer; Becton Dickinson, Heidelberg, Germany) and spiked with 1000 MCF-7, MDA-MB-231, or SK-Br-3 breast cancer cells. As negative controls, we processed three different samples without breast cancer cells. All samples were obtained with previous informed consent of healthy donors. A double-density ficoll gradient was prepared by placing 5 ml Histopaque 1077 in a tube containing an equal volume of Histopaque 1119. Blood samples were carefully placed onto the upper layer of Histopaque 1077, and tubes were centrifuged at 700 3 g for 30 min at 20C. The mononuclear cell fraction (plasma/ 1077 interphase) and granulocyte fraction (1077/1119 interphase) were isolated, and both fractions were

669

FICTION on Immunoselected CTCs From PB

mixed and washed in 50 ml PBS by centrifugation at 200 3 g for 15 min, according to previous publications (Gaforio et al. 2003).

The Journal of Histochemistry & Cytochemistry

Cell Enrichment by Immunomagnetic Separation

Tumor cells were immunoseparated using the Carcinoma Cell Enrichment and Detection Kit, with some modifications. Briefly, after cell permeabilization, the cell pellet was resuspended in 40 ml dilution buffer plus 5 ml MACS CellPerm Solution and incubated for 5 min at room temperature. Cells were fixed by adding 5 ml CellFix Solution for 30 min at room temperature. Cells were washed twice, resuspended in 600 ml MACS CellStain Solution, incubated with 200 ml Fc-Blocking Reagent, and immunomagnetically labeled with 200 ml MACS anti-cytokeratin microbeads (microbeads conjugated to a monoclonal anticytokeratin 7/8 antibody; clone: CAM5.2). After a 45-min incubation at room temperature, cells were washed, resuspended in 1 ml CellStain Solution, and placed onto a MACS MS column. Unlabeled cells were washed off the column with 3 3 500 ml dilution buffer. The column was removed from the magnetic field, and the retained cells (magnetic-positive cell population) were eluted with 1 ml dilution buffer. The magnetically enriched cell fractions were spun down onto poly-L-lysine–coated glass slides in a cytocentrifuge (Hettich; Tuttlingen, Germany) at 1500 rpm for 10 min. Slides were air-dried overnight at room temperature and stored at 220C without fixation. LSI TOP2A/HER-2/CEP17 Probes

The LSI TOP2A/HER-2/CEP17 multicolor probe includes a TOP2A probe labeled with SpectrumOrange, an ERBB2 (HER-2/neu) probe labeled with SpectrumGreen, and a chromosome enumeration probes CEP17, labeled with SpectrumAqua. FICTION

Previously published protocols for FICTION were used (Weber-Matthiesen et al. 1992), with some modifications. After thawing, slides were fixed in an ice-cold mixture of methanol and acetone (1:1) for 5 min and air dried. Slides were hydrated in PBS for 5 min and incubated for 30 min with a blocking solution (10% rabbit serum in PBS) before primary antibody incubation. The slides were washed in PBS for 5 min and incubated with the biclonal mouse anti-AE1-AE3 antibody overnight at 4C, diluted 1:200 in PBS containing 10% FCS. The revelation was conducted by applying two sequential layers of secondary antibodies (1:50 dilution in PBS for both of them, 30 min at room temperature): Alexa Fluor 350 rabbit anti-mouse IgG and goat anti-rabbit IgG. After fluorescent immunophenotyping, slides were coverslipped under PBS for evaluation under a Zeiss

Axioplan 2 epifluorescence microscope (Carl Zeiss; Jena, Germany), with appropriate filter sets. ISIS software (MetaSystems; Altslussheim, Germany) was used for evaluation throughout. After assessment of positive (tumor) cells on the slides, samples were fixed with Carnoy’s solution (3:1 methanol: acetic acid fixative), rinsed in distilled water for 1 min, fixed in 1% formaldehyde, and rinsed again in distilled water for 1 min. After dehydration in an ethanol series (70%, 80%, and 100%) and air dried, slides were codenatured with the LSI TOP2A/HER-2/ CEP17 multicolor probe for 5 min at 85C and hybridized overnight in a humidified chamber at 37C. Posthybridization wash was carried out at 72C in 23 SSC/0.3% Igepal, pH 7, for 2 min, followed by another wash at room temperature. Finally, slides were mounted with the Slow Fade Light Antifade Kit. Microscopic evaluation was carried out with the microscope and software imaging system described above. A minimum number of 50 morphologically intact and non-overlapping nuclei were scored in every sample to determine the number of hybridization signals for each ErbB2, TOP2A, and CEP17 probe. Both absolute copy numbers and the relative copy number ratio (ratio between the mean number of ErbB2 or TOP2A signals and the mean number of chromosome 17 centromere signals) were determined. A [ErbB2 or TOP2A]/CEP17 ratio $1.5 was considered gene amplification. Similarly, ratios #0.7 were considered gene deletions. Analysis of Cell Recovery

To determine the number of cells recovered, we applied the double-density ficoll gradient and immunomagnetic separation describe previously, followed by immunocytochemistry (using anti-cytokeratin antibodies) for quantification of positive cells. Briefly, we used 10 ml of blood from healthy volunteers that was spiked with 1000 cells (MCF-7, MDA-MB-231, or SK-Br-3 cell lines). After double-density ficoll gradient, immunomagnetic labeling, and separation, cells were subjected to cytospin and stored at 220C without fixation. After thawing, slides were stained with 100 ml of anticytokeratin 7/8 conjugated to FITC (isotype: mouse IgG2a) for 10 min at room temperature and further labeled with 10 ml anti-FITC antibody conjugated to alkaline phosphatase (isotype: mouse IgG1) for 10 min at room temperature. Slides were washed in PBS for 5 min, and cytokeratin-expressing cells were detected by incubation with Fast Red TR/Naphthol AS-MX substrate solution for 15 min in a moist chamber. Slides were washed in PBS, counterstained with Mayer’s hematoxylin, and mounted with Kaiser’s glycerol gelatin. Cytokeratin-expressing cells (CK1) were counted separately by two expert researchers. All experiments were done in triplicate.

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Campos, Prior, Warleta, Zudaire, Ruı´z-Mora, Catena, Calvo, Gaforio

Results

The Journal of Histochemistry & Cytochemistry

Efficiency of the TCs Immunoselection Method

Cell recovery was in the range of 60–80% for the three cell lines studied (Table 1), which is similar to what was described in previous studies (Gaforio et al. 2003). All tumor cells (CK1) showed a strong cytoplasmic staining pattern, and the cell morphology was consistent with a malignant phenotype (Figures 1A–1C). According to previous publications, although tumor cells were specifically immunoselected, some white blood cells could be seen in the positive tumor fraction (Figures 1A–1C). Immunophenotyping was also conducted with mouse anti-cytokeratins antisera followed by two layers of fluorescent antibodies (Alexa Fluor 350 rabbit anti-mouse and Alexa Fluor 350 goat anti-rabbit). This procedure rendered an excellent labeling of tumor cells for the three lines analyzed (Figures 1D–1F). FICTION Analysis of the Selected TCs

Breast cancer cells were unequivocally distinguished among the white blood cells by their blue color provided by the immunofluorescent labeling (Figures 2A–2C). The three tumor cell lines displayed a well-preserved morphology (Figures 2A–2C). Hybridization signals for ErbB2, TOP2A, and CEP17 were also clearly observed in both tumor cells and leukocytes (Figures 2A–2F). All leukocytes showed two signals for ErbB2, TOP2A, and CEP17, thus serving as internal controls. Quantitative results of the number of signals found in tumor cells are given in Table 2. The most common genetic pattern for the cell line MCF-7 was the presence of three copies of chromosome 17 (CEP17) but two copies of ErbB2 (mean, 2.02 6 0.24 copies/cell) and TOP2A (mean, 2.01 6 0.26 copies/cell; Figure 2D; Table 2). In the case of MDA-MB-231 cells, two patterns were basically found. The predominant one (accounting for 91.33% of the cells) showed trisomy of CEP17. The other one was tetrasomic for CEP17 (which was observed in 8.67% of the cells). In general, neither of these populations presented ErbB2 or TOP2A amplifications or deletions (average ratio with respect to CEP17 being 1.01 for both genes; Table 1). The cell line SK-Br-3 showed many copies of ErbB2, TOP2A, and CEP17 (Figure 2F).

The average copy number for ErbB2 was 25.87 6 7.39, whereas for TOP2A, it was 9.48 6 2.55. Gene amplification for ErbB2 (3.81-fold relative to CEP17) was found in this cell line. In negative control samples, no hybridization signals or blue-positive cells were detected.

Discussion Studies from our group and from others have shown that the number of CTCs in breast cancer patients correlates with clinical outcome (Gaforio et al. 2003; Cristofanilli et al. 2005; Mu¨ller et al. 2006). The presence of more than five CTCs in a 7.5-ml blood volume determines a bad prognosis and decreased overall survival, irrespective of the treatment received by the patients (Cristofanilli et al. 2004). These remarkable data could be even more clinically relevant if the precise genetic alterations of such cells were accurately determined. We showed here the feasibility of analyzing TCs by immunomagnetic separation and FICTION techniques to examine gene copy number of ErbB2, TOP2A, and CEP17 in CK1 (i.e., tumor) cells. Few studies have applied molecular techniques to identify genetic signatures of CTCs. The analysis by RT-PCR for mammaglobin and B305D-C in CTCs showed a sensitivity of 70% and a specificity of 81% for the diagnosis of invasive breast carcinoma (Reinholz et al. 2005). Several studies analyzing genetic defects in disseminated tumor cells isolated from bone marrow showed several chromosomal alterations (Klein et al. 1999; Schmidt-Kittler et al. 2003) and amplification of the ErbB2 gene by fluorescence in situ hybridization (FISH) (Mu¨ller et al. 1996; Schardt et al. 2005). However, the molecular characterization of CTCs in PB would be preferable to more invasive procedures, such as bone marrow aspirations. The FICTION technique was developed to assign tumor cells to a cytogenetically defined clone and, at the same time, to determine their specific cell lineage (Weber-Matthiesen et al.1992,1993). FICTION has been proven to be clinically meaningful in hematological neoplasms (Nylund et al 1993; Haferlach et al. 1997; Temple et al. 2004; Young et al. 2006). In solid tumors, three studies have applied FICTION to correlate the presence of genetic alterations with the ex-

Table 1 Recovery rates of tumor cells from peripheral blood Recovery ratesa Cell line SK-Br-3 MCF-7 MDA-MB-231 a

Number of tumor cells recovered in blood sample 1

Number of tumor cells recovered in blood sample 2

Number of tumor cells recovered in blood sample 3

Total percentage of recovery

780 681 670

760 733 657

751 742 622

76.37 71.87 64.97

To determine the number of cells recovered, 10 ml of blood from nine healthy donors was spiked with 1000 cells (MCF-7, MDA-MB-231, or SK-Br-3 cell lines). See Analysis of Cell Recovery in Materials and Methods.

671

The Journal of Histochemistry & Cytochemistry

FICTION on Immunoselected CTCs From PB

Figure 1 Peripheral blood from healthy volunteers spiked with different tumor cell lines. Mononuclear and granulocyte cell fractions were processed for positive immunomagnetic tumor cells separation and labeled using immunocytochemistry (A–C) or immunofluorescence (D–F). Tumor cells [MCF-7 (A,D), MDA-MB-231 (B,E), and SK-Br-3 (C,F)] show a solid cytoplasmic cytokeratin (CK) staining pattern, whereas the surrounding hematopoietic cells do not. Bar 5 75 mm.

pression of a particular protein (Terada et al. 2000; Zhang et al. 2000; Dettori et al. 2003). Zhang et al. (2000) used this technique in six breast carcinoma cell lines to study the relationship between estrogen re-

ceptor (ER) expression and deletion of the estrogen receptor gene (ESR). Terada et al. (2000) studied, using FICTION, 105 patients with gastric tumors, showing that the frequency of positive cells for proliferating cell

Campos, Prior, Warleta, Zudaire, Ruı´z-Mora, Catena, Calvo, Gaforio

The Journal of Histochemistry & Cytochemistry

672

Figure 2 Peripheral blood from healthy volunteers spiked with different tumor cell lines, processed by immunomagnetic enrichment and fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics as a tool for investigation of neoplasm (FICTION) techniques. Leukocytes are negative for the CK labeling and were used as positive control for the fluorescence in situ hybridization technique. Tumor cells [MCF-7 (A,D), MDA-MB-231 (B,E), and SK-Br-3 (C,F)] are clearly identified and show hybridization signals for ERBB2 (HER-2/neu) (green), TOP2A (orange), and CEP17 [aqua (light blue)]. (D) MCF-7 cells show three copies of chromosome 17 and two copies of the HER-2 and TOP2A (mean: two copies of both genes/cell). (E) The general pattern found for MDA-MB-231 cells is the presence of three signals for CEP17, HER-2, and TOP2A. (F) SKBr-3 cells show a high level of HER-2 amplification and a low level of TOP2A amplification. Observe that several signals are also seen for CEP17. Notice that not all signals from genes are in focus at the same time. Bar 5 75 mm.

673

FICTION on Immunoselected CTCs From PB

Table 2 Absolute and relative copy numbers of ERBB2 (HER-2/neu) and TOP2A genes in SK-Br-3, MCF-7, and MDA-MB-231 cells, after immunomagnetic separation from blood samples and FICTION analyses ERBB2 (HER-2/neu) copy number Cell line Leukocytesa SK-Br-3 MCF-7 MDA-MB-231

Absolute (mean 6 SD) 2.00 6 25.87 6 2.02 6 3.09 6

0.00 7.39 0.24 0.28

TOP2A copy number

Relative to 17 centromere 1.00 3.81b 0.66c 1.01

Absolute (mean 6 SD)

Relative to 17 centromere

6 6 6 6

1.00 1.40b 0.66c 1.01

2.00 9.48 2.01 3.09

0.00 2.55 0.26 0.28

a

Samples internal control, 450 cells. Gene amplification. Gene deletion. One hundred fifty cells were evaluated for each cell type (50 cells/sample). FICTION, fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics as a tool for investigation of neoplasm. b

The Journal of Histochemistry & Cytochemistry

c

nuclear antigen (PCNA) and chromosome 17 numerical aberrations were indicators of metastatic potential. Dettori et al. (2003) evaluated, using FICTION, the immunoexpression of a mitochondrial membrane antigen with a simultaneous visualization of numerical chromosomal aberrations in 18 patients with thyroid tumors. In this study, we showed for the first time that breast cancer cells isolated from PB can be analyzed by FICTION to simultaneously examine ErbB2/TOP2A/ CEP17 copy number and cytokeratins 1-8/10/14-16/19 in these cells. To ensure a high specificity of the assay in the analysis of tumor cells, we incorporated the following steps: (a) the first milliliters of blood collected from the samples were discarded to avoid contamination with squamous cells; (b) Fc receptors from cells were blocked to avoid nonspecific binding, previously to the incubation with the anti-cytokeratin mAb; and (c) application of double CK immunolabeling with an anti-CAM5.2 (cytokeratin 7/8) monoclonal antibody (for immunoselection) and with a biclonal anti-AE1/AE3 (anti-pancytokeratin) antibody (for further immunophenotyping). The genetic amplification of both ErbB2 and TOP2A in SK-Br-3 cells was previously published using FISH (Szo¨llo¨si et al. 1995; Ja¨rvinen et al. 1999,2000; Forozan et al. 2000), comparative genomic hybridization (Forozan et al. 2000; Lottner et al. 2005), and spectral karyotyping (Kyto¨la¨ et al. 2000), and is coincident with our results. The deletion of ErbB2 in MCF-7 cells (Szo¨llo¨si et al. 1995; Shadeo and Lam 2006) and the normal ErbB2 copy number in MDA-MB-231 cells (Satya-Prakash et al. 1981; Grushko et al. 2002; Lottner et al. 2005) were also previously documented and are in keeping with our data. However, no data showing the TOP2A status in MCF-7 and MDA-MB-231 cells were previously reported. Ideally, the technique we describe here could be useful for early detection of ErbB2/TOP2A-amplified disseminated breast cancer and to monitor, in a relatively easy way, the response to herceptin/anthracyclinebased therapies. However, many questions arise from our study that should be addressed in future studies.

First of all, breast cancer patients should be tested to determine the clinical value of this technique. In addition, it is currently unknown whether ErbB2/TOP2A amplifications or deletions in CTCs will represent the general pattern of aberrations of the primary tumor. ErbB2 is amplified in z20–35% of invasive breast carcinomas, and TOP2A has been found altered in almost 90% of ErbB2-amplified tumors. However, several tumors with extra copies of ErbB2 contain tumor cells with amplification and deletion of the TOP2A gene (Ja¨rvinen et al. 1999). It has been suggested that this finding may have therapeutical implications, because TOP2A deletions confer resistance to topoisomerase II inhibitors (Ja¨rvinen and Liu 2003). This could be an explanation for the gradual loss of efficacy of topoisomerase II inhibitors, which is common in breast cancer treatment. Meng et al. (2004) found that 9 of 24 patients whose primary tumors were ErbB2 negative showed ErbB2 amplification in their CTCs. However, other studies have shown that ErbB2 status was similar between breast cancer metastases and the primary tumor (Tanner et al. 2001; Dirix et al. 2005). In this scenario, one can think that disseminated circulating cells may come from subclones of tumor cells and may not be a representative sample of the whole tumor. Despite these caveats, which warrant further studies, the presence of ErbB2/TOP2A-amplified CTCs could serve as a surrogate marker to monitor targeted therapy. A rapid drop in the number of CTCs and cytokeratin19 mRNA levels has been described in patients after herceptin treatment (Bozionellou et al. 2004). It is likely that the monitoring of the number of cells carrying the specific target against which drugs were designed (whether is herceptin or anthracyclines) would be suitable for testing the efficacy of such therapy. Although we describe here a FICTION method for the analysis of ErbB2/TOP2A/CEP17 status in TCs from PB, many other breast cancer targets could be analyzed using a similar technology. For instance, a recent paper showed that node-negative breast cancer patients with 11q deletion might benefit from anthracycline-based chemotherapy (Climent et al. 2007).

674

Campos, Prior, Warleta, Zudaire, Ruı´z-Mora, Catena, Calvo, Gaforio

In summary, we showed the feasibility of a new methodology that combines immunomagnetic selection and FICTION for ErbB2/TOP2A/CEP17, which could allow genetic characterization of CTCs from PB. Acknowledgments This study was supported by the “Fundacio´n de Investigacio´n Me´dica Mutua Madrilen˜a” (to JJG) and partially funded by an ISCIII-RETIC RD06/0020 grant (to AC).

The Journal of Histochemistry & Cytochemistry

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Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Capítulo 3 Detección de células tumorales circulantes (CTCs) en sangre periférica de pacientes con cáncer de colon no metastásico Análisis del valor pronóstico de este nuevo marcador Verificación de la utilidad de la nueva metodología desarrollada y posibilidad de evaluar otros marcadores tumorales en las CTCs aisladas Trabajo enviado para publicación, con título: “Simultaneous phenotypic and genetic characterization of single circulating tumor cells from colon cancer patients”, a la revista BMC Cancer. - Índice de impacto de la resvista = 3,15 - Categoría a la que pertenece: Oncología - Cuartil que ocupa: segundo cuartil - Rango en la categoría (2010): 66/185.

137

Simultaneous phenotypic and genetic characterization circulating tumor cells from colon cancer patients.

of

single

María Campos1, Rafael Luque 2, Juan Jiménez3, Rafael Martínez4, Fernando Warleta 1, Cristina Sánchez-Quesada1, Miguel Delgado-Rodríguez5,6, Alfonso Calvo7 and José J Gaforio1* Adress: 1Immunology Division. Department of Health Sciences. Faculty of Experimental Sciences. University of Jaén, Campus Las Lagunillas s/n, 23071 Jaén, Spain, 2Department of Pathology, University Hospital of Jaén, Ejército Español Avenue nº 10, 23007 Jaén, Spain, 3Department of Surgery, University Hospital of Jaén, Ejército Español Avenue nº 10, 23007 Jaén, Spain, 4Department of Internal Medicine, University Hospital of Jaén, Ejército Español Avenue nº 10, 23007 Jaén, Spain, 5Division of Preventive Medicine and Public Health. Department of Health Sciences. Faculty of Experimental Sciences. University of Jaén, Campus Las Lagunillas s/n, 23071 Jaén, Spain, 6Biomedical Network Research Center for Epidemiology and Public Health (CIBERESP). Ministry of Science and Innovation and 7Division of Oncology. Center for Applied Medical Research (CIMA) and Department of Histology and Pathology, University of Navarra, Pio XII, nº 55, 31008 Pamplona, Spain. Email: María Campos - [email protected]; Rafael Luque - [email protected]; Juan Jiménez - [email protected]; Rafael Martínez [email protected] ; Fernando Warleta - [email protected]; Cristina Sánchez-Quesada - [email protected]; Miguel Delgado-Rodríguez [email protected]; Alfonso Calvo - [email protected]; José J Gaforio* - [email protected] *Corresponding author

Abstract Bakground: Since circulating tumor cells (CTCs) have metastatic potential, their genetic and phenotypic characteristics could provide crucial information to establi sh the most effective therapy . We assessed t he clinical utility of a methodology that allows the si multaneous analysis of CTCs phenoty pe and genotype in colon cancer patients and, in a ddition, whether this methodology could provide co mplementary information to the one obtained by the primary tumor biopsy.

Methods: Thirty-three non-metastatic (stages 0-III) colon cancer patient s and 9 healthy donor sam ples were evaluated. All periphera l blood sa mples (10 ml) were analyzed by cytokeratin immunomagnetic enrichment. Eight samples were analyzed by immunocytochemistry and 25 samples were analyzed by FICTION technique for simultaneous cytokeratin expression and chromosome 17 and ERBB2 gene status. A further study was carried out in one patient who showed CTCs heterogeneity in chromosomal abnormalities. We analyzed HER2 protein expression on CTCs and FISH and HER2 protein expression in primary tumor of this patient.

Results: Our results show that 9.09% of pat ients had cytokeratin-positive CTCs (CK+/CTCs in peripheral blood. One of the patient s showed heterogeneity in chro mosomal 17 a bnormalities and two different CK expression patterns on CTCs: one CK+/CTCs and one CK-/CTCs. Furthermore, 63.33% of these CTCs overexpressed HER2 protein while the primary tumor of this patient was diploid and did not express HER2 protein.

Conclusions: We describe a methodology that allows the simultaneous analysis of genetic and phenotypic of CTCs in colon cancer patients, which may provide e ssential information to select p atients who might benefit from specific therapy. Different genetic alterations that have b een described in

Background Colon cancer is one of the most common types of tumors in developed c ountries [1]. Despite the i mprovement of survival rates achieved with the use of new chemotherapy agents, approximately 20% of stag e II patie nts will die from recurrent disease [2], which shows the need of more effective therapies.

colorectal cancer may represent novel candidates for tailored therapy, such as: i) alteratio

ns in protoonc ogen C-MYC

(located on ch romosome 8) that encodes a transcription factor that is one of the

most potent a nd frequently

deregulated oncoproteins in human cancers [3]; ii) alterations in ERBB2 gene (located at chro mosome 17), member of the EGFR family, is a comm on target for breast cancer, but recent studies have found overexpression or amplifications in other solid tu mors, such as lung, gastric and colorect al

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cancers [4–6]. This offers the possibility of testing ERBB2targeted drugs, including trastuzumab and lapatinib, in these subpopulations of patients

[7–11]. Overexpression or

amplification of ERBB2 h as been reported i n 3%-14% of primary tumors from colorectal cancer patient s [4, 12–14], some authors have suggested that the addition of trastuzumab to chemotherapy might increase the clinical response in these colon cancer patients [7-12, 14]. The detection of circulating tumor cells (CTCs) appears to be an important prognostic marker for different tumor types such as breast cancer where it serves as a progression marker and indicator of overall survival

[15–18]. In addition, the

detection of CTCs identifies therapy resistant breast cancer patients [19–21]. The prognostic significance of CTCs in colorectal cancer is not clear yet, recent rep orts suggest an association with overall survival and disease progression [22– 24]. However, little attention has been paid to the cytogenetic features of such cells.

cancer patients with the go al of evaluating E RBB2 status in such CTCs. Our methodology allows u s to analy ze simultaneously the ERBB2 phenotype and genotype of single cytokeratin positive (CK+)/ CTCs isolated from peripheral blood (PB) by immunomagnetic separation and FICTION of 33 patient s had dete ctable

CK+/CTCs (9.09%) and 1 of them had CK+/CTCs with strong HER2 expression. CK+/CTCs in this patient we re triploid for chrom osome 17 and did not show ERBB2 amplification, while the pri mary tumor showed disomy for this chromosome and ERBB2 gene, and were negative for HER2 protein expression. Therefore we were able to identify CTCs in PB with differe

nt genetic and phenotypic

characteristics to the ones found in pri mary tumor biopsy. Since CTCs are linked to tu mor recurrence and metastasis, CTCs´ genotype and phenotype analysis could also complete the real status of the disease tumor analysis.

Cell lines and controls The human colon cancer cell lines Caco-2, HT-29, and human breast cell lines MCF-7 MDA-MB-231 were obtained from the American Type Cultured Collection (ATCC; Rockville, MD). The human breast can cer cell line SK-Br-3 (with ERBB2 amplification and overexpression) was obtained from Eucellbank (Barcelona, Spain). MCF-7 and MDA-MB-231 cells were grown in MEM with Earle´s salt (PAA Laboratories, Pasching, Austria), supp lemented with 10%

(v/v) heat-inactiv ated

fetal calf

serum

(PAA

Laboratories, Pasching, Austria) and 1% of a stock sol ution of penicillin-streptomycin (Sigma, St. Louis, MO). Caco-2, HT-29 and SK -Br-3 cells w ere grown in RP MI 1640 (PAA Laboratories, Pasching, Austria), plus 10 % (v/v) heatinactivated fetal calf seru m and 1% of a stock solution of penicillin-streptomycin. Cells in the exponential growth phase were used for the experim ents. These cancer cell lines

In this study we analyzed CTCs of 33 n on-metastatic colon

[25]. We found that 3 out

Materials and methods

with metastatic and pri mary

were used as positive co ntrol. Briefly, we spiked 1000 of each tumor cells lines in 10 ml of peripheral blood (PB) from 6 healthy donors (one sa mple of blood per each tu mor cell line except for SK-Br-3 control that was duplicated), under an approved ethical protocol and signed informed consent. Previously, we validated the absence of CTCs in PB fro m healthy donors as neg ative controls. Besides these healthy donor samples, we al so evaluated three PB samples of patients with diverticulosi s disease (benign inflammatory disease) as n egative controls. Positive con trols, negative controls and patient´s samples were carried out separately to avoid cross contamination and were processed following our previously published FICTION protocol [25].

Study population and clinicopathologic examination Informed consent was obtained from all participants following and explanation of the nature of the study

, as

approved by the research ethics board of ou r hospital. Al l patients were c onsidered sporadic cases on th e basis that no clinical antecedents of fa milial adenomatous poliposis were reported, and those who met the clinical criteria for hereditary nonpolyposis colon can cer (Amsterdam criteria) were excluded. Between June 2004 and November 2005, bloo d samples (10 mL) were tak en from 33 non-metastatic colon cancer patients (stages 0-III) by venipuncture, the day before surgery. All pa tients were followed up until death or until

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August 11, 2007. Follow-up of the patients was carried out

The following variables were obtained from the medical

every 6 months and included recording of the development of

records of t he 33 pati ents: Age, gender, tumor location,

local and distant tumor relapse and th e survival stat e of the

pathologic stage, histological differentiation and type, lymph

patients.

node metastases, tumor invasion, and evid ence of poly ps (defined by the presence of polyps in the surgical sam

ple).

Pathologic stage was assessed using tumor-node-metastases (TNM) classification (Table 1). Table 1: Correlation among CK+/CTCs and clinical/morphological variables

Clinical

or

pathological

Number of CK+/CTCs/10 ml

variables Gender Male Female Tumor location Ascending colon Transverse colon Descending colon Sigmoid colon Transverse-sigmoid colon Grade of differentiation Well Moderate and moderatePoor TNM 0 I II III Histological type Adenocarcinoma Mucinous adenocarcinoma Intramucosal Tumor configuration Excrescent Excrescent-infiltrative Infiltrative Polyploid Ulcerative Ulcer vegetative Vegetative Tumor invasion Lymphatic + Venous + Perineural (n=10) +

p value

CK+ patients

CK - patients (%)

2 (6.06%) 1 (3.03%)

20 (60.60%) 10 (30.30%)

2 (6.06%) 0 (0.00%) 0 (0.00%) 1 (3.03%) 0 (0.00%)

12 (36.36%) 1 (3.03%) 12 (36.36%) 4 (12.12%) 1 (3.03%)

2 (6.06%) 0 (0.00%) 1 (3.03%)

10 (30.30%) 13(39.39%) 5 (15.15%)

0 (0.00%) 0 (0.00%) 1 (3.03%) 2 (6.06%)

2 (6.06%) 3 (9.09%) 10 (30.30%) 15 (45.45%)

3 (9.09%) 0 (0.00%) 0 (0.00%)

26 (78.78%) 2 (6.06%) 2 (6.06%)

0 (0.00%) 0 (0.00%) 1 (3.03%) 0 (0.00%) 1 (3.03%) 1 (3.03%) 0 (0.00%)

6 (18.18%) 1 (3.03%) 7 (21.21%) 5 (15.15%) 1 (3.03%) 9 (27.27%) 1 (3.03%)

2 (6.06%) 1 (3.03%)

15 (45.45%) 15 (45.45%)

0.523

0 (0.00%) 3 (9.09%)

3 (9.09%) 27 (81.81%)

0.744

1 (3.03%)

8 (24.24%)

0.629

- 2 (6.06%) 2 (66.67%)

0.718

0.477

0.289

1.000

1.000

0.501

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Blood samples, density gradient separation and

Bergisch Gladbach, Germany), counterstained with Mayer´s

CK+/CTCs enrichment by immunomagnetic

hematoxylin, and mounted with Kaiser´s glycerol gelatin

separation

(Merck,

Peripheral venous blood samples (10 mL) were collected from colon cancer patients before surgery. PB samples were collected in h eparinized tubes (BD V acutainer, Becton Dickinson; Heidelgerg, Germany) and were processe within 4 hr after collection. Eight PB

d

samples were

processed according to th e methodology previously described by our group [ 15] and 25 PB samples were

Darmstadt,

Germany)

following

our

immunocytochemistry protocol [ 15]. CK+/CTCs wer e counted separately by two expert researchers.

Detection of CK+/CTCs by FICTION (Fluorescence immunophenotyping and Interphase Cytogenetics as a Tool for Investigation of Neoplasm) Twenty five PB sa mples were processed by FICTION [25].

processed following our FICTION protocol [25].

Briefly, after thawing and fi xation, these sam ples were

Briefly, a double-density ficoll gradient was prepared per

(Sigma, St. Louis, MO)) followed by primary antibody

PB sample (Histopaque 1119 and Histopaque 1077 (Sigma,

incubation with the biclonal mouse anti-AE1-AE3 antibody

St. Louis, MO)). After centrifugation, the mononuclear cell

(BioGenex, San Ra mon, CA). The develop

fraction and the granulocyte fraction were isolated. Then

conducted by applying 2 se quential layers of secondary

tumor cells were immunoseparated using the Carcinoma

antibodies: Alexa Fluor 350 rabbit anti- mouse IgG and goat

Cell Enrichment and Detection Kit ( Miltenyi Biotec,

anti-rabbit IgG (Invitrogen, Eugene, OR). Aft er fluorescent

Bergisch Gladbach, Germany), with so me modifications.

immunophenotyping, slides were evaluat ed under Leica

After nucleated cells were i solated, permeabilizated and

TCS-DL confocal laser scanning system with argon and two

fixed, the sa mples were incubated with Fc-Blocking

helium neon lasers on a Leica D M IRB in verted

Reagent and immunomagnetically labeled with MACS anti-

microscope, with appropriate filter set. Blue fluorescent

cytokeratin microbeads (microbeads conjugated to a

images were acquired with Leica DFC 300FX digital

monoclonal anti-cytokeratin 7/8 antibody; clone: CAM 5.2).

camera and pr ocessed with Leica IM50 i mage manager.

After this, sa mples were placed onto a MACS Column

Confocal images were acq uired and processe d using Leica

(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) and the

confocal LCS software (Leica Microsystems; Wetzlar,

retained

Germany).

cells

(magnetic-positive

cytokeratin-positive

(CK+)

cell

incubated with a blocki ng solution (10% rabbit serum

population;

cells) were eluted. The

magnetically enriched cell fra ctions were spun down onto poly-L-lysine-coated glass slides (Sigma, St. Louis, MO) in a cytocentrifuge (Hettich; Tuttlingen, Germany). Then slides were air-dried over nig ht at roo m temperature and

ment was

After assessment of po sitive tumor cells on the slid es, samples were fixed and dehydrated in seri es of ethanol (Panreac Quimica, Barcelona, Spain). Afterwards, sa mples were codenatured (85ºC for 5

min) and hybridized

stored at -20ºC without fixation.

(overnight at 3 7ºC) with the LSI HER2/CEP17 multi-color

Detection of CK+/CTCs by immunocytochemistry

SpectrumGreen and a chromosome enumeration probe

Eight PB samples were processed by immunocytochemistry.

CEP17 labeled with Spectrum Aqua) (Abbott Molecular,

After thawing, slides were stained with anti-cytokeratin 7/8

Vysis; Des Plaines, IL). Posthy bridization wash w as

conjugated to FITC (isotype: mouse IgG2a. Miltenyi Biotec,

performed at 72ºC in 2xSodiu m chloride citrate buffer

Bergisch Gladbach, Germany) and further labeled with anti-

(SCC) (MP Biomedicals Europe, Illkirch, France)/0.3%

FITC antibody conjugated to alkaline phosphatase (isotype:

Igepal (Sigma, St. Louis, MO) for 2 min, followed by

mouse

another wash at roo m temperature [25]. Microscopic

IgG1,

Miltenyi

Biotec, Bergisch Gladbach,

probe,

(ERBB2 (HER2/

neu)

probe l

Germany). Then sa mples were incubated wi th Fast Red

evaluation was carried out

TR/Naphthol AS-MX substrate solution (Miltenyi Biotec,

described above by two expert researchers.

abeled

with

with the Leic a microscope

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Analysis of hybridization

Newcastle upon Tyne, UK); and

All CK+/CTCs were scored to deter mine the nu mber of

Newcastle upon Tyne, UK). Immunohistochemical staining

hybridization signals for eac h ERBB2 and CEP17 probe.

was performed with a sen sitive polymer-based system

The absolute c opy numbers and the relative copy number

(Dako

ratio (ratio between the absolute number of ERBB2 si gnals

diaminobenzidine (DAB) solu tion as a chrom ogen (Dako,

in each CK+/CTC and the ab solute number of their own

Glostrup, Denmark). All in cubations were carried out at

chromosome 17 centromere signals) were determined. For

room temperature. The sa mple was counterstained with

FISH evaluation a [ ERBB2]/CEP17 ratio v alue •1.5 was

Mayer’s haematoxylin (Merck, Dar mstadt, Germany) and

considered to be an in crease copy number of the gen e.

mounted using standard procedures. Positive and neg ative

Similarly, ratio value ”0.7 was considered to be a decrease

(substituting the primary antibody by distilled water)

copy number or the gene, a nd ratios b etween 1.3 and 1.5

controls were included in

were considered as equivo cal values, and were interpreted

prognostic factors by the American College of Pathologists

with caution.

were recorded.

Statistical analysis

The assessment of i mmunohistochemistry was conducted

The patient characteristic s were related to the presenc e of CK+/CTCs in PB by using Fisher´s exact test. When a variable was ordered a trend analysis was applied. Actuarial curves for progression-free

survival (PFS) and o verall

survival (OS) were calculated by the Kaplan-Meier method. PFS and OS were calculated from the date of the pri mary detection of CK+ cells in PB to th e date of disea se progression or death. Dise ase progression was defined a s recurrence of the patients.

using

EnVision

an Oly

system,

mpus

CD34 (Novocastra,

Glostrup,

Denmark)

the kit. All reco

BH-2

microscope

with

mmended

(Olympus;

Hertfordshire, United Kingd om) attached to a Nikon Coolpix 5400 camera for acqu isition of digit al images. All markers were quantitated using random fields that w ere recorded as dig ital images under high power view (x400) and counting a mean of 1000 cells per marker with the aid of the Im ageJ software for im age analysis (ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997-2007).

FISH of primary tumor Study of patient with identification number (IN) 28 Due to the gen etic characteristics of the CK+ /CTCs found in IN 28 patient, we conducted a further study of this patient by assessing several tumor markers, genetic characteristic of the primary tumor and the expression of HE R2 protein i n CK+/CTCs of this patient.

The ERBB2 e valuation by FISH was perfo rmed on tw o sections (3 μm) from paraffin-embedded tissue sample. Briefly, after paraffin was r emoved the sections were rehydrated in e thanol series and treated with hydrochloric acid (Panreac Quimica, Barcelona, Spain), followed by a treatment with 8% Sodium thiocyanate (Panreac Qui mica, Barcelona, Spain) and digested with 0.025% pepsin (Sigma, St. Louis, MO ) in hy drochloric acid. Sa mples were th en

Immunohistochemistry of primary tumor Immunostaining of pri mary tumor sample was assessed by Department of Pathology (University Hospital of Ja én) on

rinsed with 2xSSC, dehydrated in et hanol series and air dried at room temperature.

routinely processed paraffin sections using the citrate buffer

Next, dual-color probe PoseidonTM

(pH 6) (Master Diagnostica, Granada, Spain) as an antigen-

ERBB2, HER2/Neu (17q12) & SE 17 Cont rol probe (red

retrieval method. Sections were examined with monoclonal

color for ER BB2, and gr een for SE1 7) (Kreatech

antibodies (mAbs) recognizing p53 (Novocastra, Newcastle

Diagnostics, Amsterdam, The Netherlands) were added t o

upon Tyne, UK); cyclin D1 (Dako, Glostru p, Denmark);

slides and code naturation (75ºC for 10 min), hybridization

HER2 (Dako, Glostrup, Den mark); Ki-67 (Concept a

(overnight at 37ºC) and po sthybridization wash (72ºC in

Biosystems,

1xSSC for 2 min, followed by 1xSSC at roo m temperature)

Barcelona,

Spain); CD31

(Novocastra,

Repeat FreeTM

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were performed following the Kreatech Diagnostic´s recommended protocol. Slides were mounted with DAPI I counterstain (Abbott Molecular, Vysis; Des Plaines, IL).

Results Detection of CK+/CTCs in colon cancer patients Blood samples from 33 consecutive patients with colon

Evaluation of the hybridization was done with a Zeiss

cancer were ta ken to measure CK+/CTCs levels, and no

Axioplan 2 epi fluorescence microscope (Carl Zeiss; Jen a,

statistical association was found between presence of

Germany), with the appropriate filters set. ISIS software

CK+/CTCs and any of the variables studied (Table 1). The

(MetaSystems; Altslussheim, Germany) was used to capture

negative controls, PB samples from three patients with

the images. 100 tumor nuclei were examined and alterations

diverticulosis disease and 6 healthy volunteers were

of the number of signals were evaluated following standard

negative for CK+ cells´ detection.

procedures.

CK+/CTCs were detected in 3 out of 33

PB sa mples

Immunostaining of CK+/CTCs with anti-HER2 mAb

(9.09%). The mean number of CK+/CTCs isolated in th ese

(HercepTest, Dako)

3 patients was 9.67 (range 1 -26 CK+ cells), relationship

After FICTION evaluation, IN 28 sam ple was dismounted, rehydrated and the anti-HER2 antibody

was applied a s

described in th e section Immunohistochemistry of prim ary tumor. Positive controls, in

which FICTI ON had b een

evaluated, were included i n the i mmunostaining of CK+/CTCs with anti-HER2, i n order to have a control of the immunocytochemistry. These controls followed the same process as described for the IN28 sa mple, except for one of the SK -Br-3 controls that was u sed as a neg ative control (substituting the pri mary antibody with distilled water to a ssure that cro ssed reactions or false positive results did not occur).

between the presence of CK+/CTCs and OS or/and PFS was not found ( median follow-up = 13 months; range = 0.529.9). Regarding the three CK+/CTCs patients, one of them was analyzed by immunocytochemistry and showed one CK+/CTC with a stron g cytoplasmic staining pattern, whereas the surrounding he matopoietic cells showed no CKs expression (data not shown). The genetic characteristic of this CK +/CTC could not been studied due to technic al problems. The other two

samples were analyzed by

FICTION and results are show in the section FICTION analysis on the immunoselected CK+/CTCs.

Analysis of HER2 expression

Characterization of tumor cells lines by FICTION

Tumor cell lines and CTCs from IN 28 sa mple were scored

and HER2 expression

according to manufacturer’s guidelines. Score 0 defined as no staining of tumor cells, score 1+, as faint staining of the se cells; score 2+, as weak

membrane to moderate

membrane staining; and a score of 3+, a s strong staining of

We first establ ished the characterization of the FICTION technique, using tumor cell li nes spiked in blood samples from healthy volunteers.

the entire membrane with perinuclear reinforcement.

Carcinoma cell lines in positive controls were unequivocally

Samples were considered negative when a score 0 or 1+

distinguished among the white blood cells by their CK blue-

staining were found in > 1 0% of tu mor cells, while they

labelling (Fig. 1). Hy bridization signals for ERBB2 and

were considered positive when score 2+ or 3+ was observed

CEP17 were also clearly observed in both tumor and white

in > 10% of the se cells. Microscopic evaluation was carried

blood cells (Fig. 1). All leukoc ytes showed two signals for

out with the Leica microscope described above.

the ERBB2 gene and centromere 17, thus serving as internal controls for the hybridization. The five positive controls (SK-Br-3, Caco-2, HT-29, MCF7 and MDA- MB-231) and SK-Br-3 negati ve control (in which we have substituted the primary antibody by distilled

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water), were a nalyzed for the i mmunostaining with anti-

tumor cells displayed a moderate staining (annotated as 2+)

HER2 protein. Different expressio n patterns were found on

and MDA-MB-231 cells were negative for HER2 protein

each positive control (Fig. 1). SK-Br-3, Caco-2 and HT-29

expression.

tumor cells showed a strong staining (3+ score). MCF-7

Figure 1. Fluorescent images (x100 objective) of PB from healthy volunteers spiked with different tumor cell lines [HT-29, Caco-2, SK-Br-3, MCF-7 and MDA-MB-231] processed by immunomagnetic enrichment and FICTION techniques (scale bar: 12.32 μm). Column “Cytokeratin” displays the CK labelling of tumor cells which are clearly identified as blue fluorescent, evaluation by fluorescence microscopy. Columns “Chromosome 17” and “ErbB2” show the hybridization signals for CEP17 and ERBB2 (HER2/neu) respectively (overlay of different planes), evaluated by confocal microscopy. Column “Photomontage” displays the overlay of Cytokeratin (blue), Chromosome 17 (aqua or light blue) and ERBB2 (green). Column “Transmission” shows the morphology of tumor cells, analyzed with confocal microscopy. The expression of HER2 protein is shown in the last column “HER-2”. These cells are different from the ones photographed in the other columns.

FICTION analysis on the immunoselected

the efficiency of hy bridization, a minimum of 5 0

CK+/CTCs

morphologically intact and

Criteria for CK+/CTCs identification consisted of nucleated

normal cells (contaminated leukocytes) were scored p er

cells with a malignant phenotype (Fig. 2 “ Transmission column” shows a representative example of morphology of isolated CK+/CTCs), staining positive for cytokeratin (CK+ cells) in blue fluorescence. Results were expressed as number of CK+/CTCs per 10 mL PB. In addition, to ensure

non-overlapping nuclei of

sample and used as internal control. IN 21 Patient: A total of 2 i ntact cells were detected as CK+/CTCs in this patient. These CK+/CTCs were evaluated for the hy bridization of ERBB2 gene signals. Both

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CK+/CTCs presented disomy for this chromosome and

presented disomy for this chromosome (11.54%) (Table 2).

showed 2 copies for ERBB2 gene (data not shown).

The CEP17 average number of copies for the se CK+/CTCs

IN 28 Patient: A total of 26 intact CK

+/CTCs with a

malignant phenotype were found in this patient. Among the 26 CK+/CTCs studied, 23 CK+/CT Cs showed polysomy (trisomy) for chrom osome 17 (88.46%) and 3 CK+/CTCs

was 2.88 c opies per cell. 20 CK+/CTCs (out of these 26 CK+/CTCs) were evaluated in terms of a bsolute copy number of E RBB2 signals. Four CK+/CTCs (4/20) presented 3 copies for this gene (20.00%) a nd 16 (16/20) showed

2

copies

for

ERBB2

gene

(80.00%).

 Figure 2. Fluorescent images (x100 objective) of CK+/CTCs isolated from PB from IN 28 patient (scale bar: 12.32 μm). Column “Cytokeratin” display the CK labelling of these cells which are clearly identified by their blue fluorescence. Samples were analyzed by fluorescence microscopy. Columns “Chromosome 17” and “ErbB2” show the hybridization signals for CEP17 and ERBB2 (HER2/neu) respectively (overlay of different planes, confocal microscopy). Column “Photomontage” displays the overlay of Cytokeratin (blue), Chromosome 17 (aqua or light blue) and ERBB2 (green). Column “Transmission” shows the morphology of CK+ cells (confocal microscopy). The expression of HER2 protein is shown in the last column “HER-2”. All CK+/CTCs are the same that those photographed in the other columns.

In summary, amplification of ERBB2 ge ne was not

17 columns” shows a repre sentative example of ERBB2

detected. The ERBB2 gene status for these CK+/CTCs was

gene and chromosome 17 status of isolated CK+/CTCs.

2.20 copies p er cell. Figure 2, “ ERBB2 and Chromosome

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Table2.Chromosomal 17 aneusomy according to HER2 protein expression scoring on CK+/CTCs from IN 28 patient.

Chromosomal

Nº of

% of

aneusomy

CK+/CTCs

CK+/CTCs

23

88.46%

HER2 protein expression score

Nº of Trisomy

CK+/CTCs Nº of 3

11.54%

1+

2+

3+

2+/3+

0

8

5

6

11

0%

42.11%

26.32%

31.58%

57.89%

0

0

2

0

2

0%

0%

100%

0%

100%

0

8

7

6

13

0%

38.09%

33.33%

28.57%

61.90%

CK+/CTCs 19

CK+/CTCs % of

Disomy

Total

0

2

CK+/CTCs % of CK+/CTCs Nº of

Total CK+/CTCs

CK+/CTCs

21

26 % of CK+/CTCs

HER2 protein expression on CTCs

Figure 3. HER2 expression on CK-/CTCs (x100

Evaluation of HER2 protein expression was only possible in

objective) from IN 28 patient. The score of HER2

21 of the 26

protein expression is shown in the lower right corner of

CK+/CTCs. HER2 overexpression was

detected in 13 of 21 CK+/ CTCs (61.90%); 6 CK+/CT Cs

the images (scale bar: 12.32 μm).

showed a 3 + staining and 7 CK+/CTCs presented a 2 + staining. Eight CK+/CTCs (38.10%) displ ayed a faint membrane staining and were scored as negative-expression. Finally, 5 out of these 26 CK+/CTCs were not evaluabl e. Figure 2 “ HER2 column” shows a represe ntative example of HER2 expression on the isolated CK+/CTCs. In addition, we found 9 tu mor cells that were CK negative (CK-)/CTCs, but histop athological examination revealed that they were tu mor cells. In these 9 CK-/CTCs, HER2 overexpression was detect ed in 6 of the

m, with a 3+

staining; and 3 tumor cells, showed faint membrane staining (scored as negative for HER2 expression) (Fig. 3). In

Immunohistochemistry and FISH of the primary tumor tissue for IN 28 patient

summary, 19 (13 CK +/CTCs and 6 CK-/CTCs) CTCs had

Focusing on IN 28 patient ( stage II) we decided to make a

HER2 overexpression (63.33%) and 11 (8 CK+/CTCs and 3 CK-/CTCs) CTCs were negative for HER2 (36.67%).

deeper

study

of the pri

mary

tumor.

Histological

examination revealed an infiltrative adenocarcinoma (Fig. 4) without po sitive nodes or distant metastases (he was followed up until April 15, 2008). May er’s haematoxylin & eosin-stained slides showed high grad e of tu mor´s aggressiveness (Fig. 4A; B). The tu mor stained strongly for Ki-67 (up to 9 0% of stained cells) (Fig. 4E), cy clin D1

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(about 50%) (Fig. 4G), with nearly

nil expression of p53

(Fig. 4F) and no expression of HER2

(Fig. 4H).

Immunohistochemical demonstration of CD3 1 and CD34

showed well developed microvasculature as well as the presence of tum our cells within small vessels (Fig. 4C; D respectively).

Figure 4. Histopathological features of the tumor from IN 28 patient (stage II). (A) Neoplastic glands with infiltrative pattern of growth affecting the muscular propria layer of the bowel. Haematoxylin-eosin, x10 objective. (B) Detail from the neoplastic glands, atypical but well conformed, although fused glands are present. Note the presence of lymphovascular (small vessel) invasion (arrowhead). Haematoxylin-eosin, x40 objective. (C-G) Immunohistochemical expression of the markers in the tumor, showing high microvessel density as seen by CD31(C) and CD34 (D) immunostaining. The arrowhead corresponds to small vessel invasion. High proliferative index (Ki-67) (E), low p53 expression (F), high expression of cyclin D1 (G) and Herceptest (H) negative test define the molecular characterization of this tumor (insert into the lower right quadrant of figure: Positive control from intraductal breast carcinoma). All figures: Envision ® method, x20 objective.

FISH analysis of different two sectio ns, demonstrated no

the genetic status of this gene in our series of patients. W e

ERBB2 amplification and disomic pattern for chromosome

have also chosen the a nalysis of ERBB2/ HER2 protein

17 (data not shown). The negative expression of HER2 is in

because there is a monoclonal antibody against this protein

line with the F ISH result found in th e primary tumor, but

that is nowadays being used in breast cancer treatment [30,

neither of them matched with the CK+/CTCs´ results of this

31]. Furthermore, this treatment could be used in other types

patient.

of tumors with ERBB2 amplifications or HER2 protein overexpression [9, 32] and in patient

Discussion In this

amplified or HER2+ CTCs [26].

study, we analy zed genetic

chromosome 17 and ERBB2 gene by

alterations

of

FICTION in

CK+/CTCs of 25 PB sa mples from a total of 33 nonmetastatic colon cancer patients (stages 0-III). Some studies in breast cancer have de monstrated that HE R2 expression can be acquired in CTCs from HER2 negative tumor during tumor progression [26, 27, 28], and that detec tion of these CTCs with overexpression of

s with ERBB2-

HER2 could be associate d

with a worst prognosis [29]. Therefore, we decided to study

It should be noted that only few studies have been focused on the genetic characteristics of CTCs in cancer patients. Only two reports have applie d cytogenetic techniques in search of chromosome aneuploidies in of CTCs from PB in metastatic [33] and non- metastatic colon cancer patients [34]. One of the m indicates that CTCs were heterogeneous for

chromosomal

abnormalities

and

the

gain of

chromosomes was more frequent than the genetic loss [33]. These results are in agreement with findings in other tumors

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types, such as breast [33] or prostate cancer [33, 35]. Only

Our finding of the existe

few studies have applied F ISH technique to evaluate

population in the same PB sample, and the tumor cells CKs

specific genes status in CTCs such as the concordance of

expression variability are in keeping with th e results shown

ERBB2 amplification in CTCs and primary tumors in breast

in metastatic colon [33], prostate and breast c ancer patients

cancer patients [26, 36]; or t he amplification of androge n

[40]. The fact that CTCs in

receptor (AR) and MYC g enes in CTCs from prostate

HER2, whereas the primary tumor did not, can be explained

cancer patients [35].

by the possibi lity that these CTCs

In this article, we have d emonstrated the utility of a method that combines an immunomagnetic selection of CTCs from peripheral blood of colo n cancer patients with FICTION technique. FICTION techniqu e was developed by WeberMatthiesen et al. (1992)

to assign tumor cells a

cytogenetically defined clone and to determine their specific cell lineage at one time. FICTION technique allows genetic and

phenotypic

CTC cha racterization

without

cell

membrane destruction and subsequent cell´s relocalization, which typically is done in FIS H, which the subsequent time consuming and loss of ev

aluable tumor cells [ 35].

Furthermore, we demonstrate the feasibility to study second marker expression by immunocytochemistry on the sa me CTC. The most interesting finding i n this work wa s, apart from demonstrating the validity of the tec hnique to analy ze simultaneously CK+/CTCs´ phenotype and genoty pe, the discovery of a gain in

chromosome 17 and HE R2

overexpression in a patient with HER2 ne gative primary tumor. FISH analy sis of the pri mary tumour demonstrated disomy for chromosome 17 and ERBB2 gene. A total of 26 CK+/CTCs were isolated from the PB of this colon cancer patient. These tumor cells were an heterogeneous cell population with basically two patterns. The predo minant

nce of a heteroge neous CTCs

this patient o verexpressed may come from an

unusual subclone of tu mor cells that

are not readily

detectable by primary tumor biopsy. Alternatively, CTCs could express HER2 de n ovo, since thi s may confer a survival advantage to metastatize. Obviously, we c annot conclude

that

colon canc er

patients

with

HER2

overexpression in CTCs should be treated with trastuzumab (Herceptin) therapy. However, it is worth

noticing that

breast cancer p atients with ERBB2-amplified CTCs were treated with tra stuzumab and showed a partial or co mplete remission [26]. Other fe w studies hypothesize that HER2 CTC status determination could be a tumoral marker for the use of HER2-targeted th erapies [27, 28]. Future stu dies would be needed to determine the convenience of targeting ERBB2/HER2 in colon cancer. We have only detected 3 CK+/CTCs in a total of 33 (9.09%) non-metastatic colon cancer patients. In addition, CK+/CTCs detection did not correlate with pri mary tumor characteristics or with PFS or OS. This percentag

e of

CK+/CTCs-positive patients i s lower than those publi shed in previous studies [23, 24, 41]. However, other studie s have reported similar percentages of CTCs in PB to th ose showed in our study [34, 42]. The main difference between these two sets of studies is the study population, which may explain the disparity found between these results.

one (~88.00%) showed trisomy of chromosome 17 and the

In metastatic colorectal cancer patients [23, 43, 44], where

second pattern was ch aracterized by disomy for thi s

the sample collection was taken postoperatively and before

chromosome

a chemotherapy treatment was initiated, a nu mber of CTCs

(~11.00%).

Both populatio ns

of these

CK+/CTCs presented 2 copies of ERBB2 gene (~80%) but

higher than 2 or 3 correlated with shorter OS and/or PFS

neither of th em had ERBB2 amplifications. In contrast,

[41, 43] and th e only presence of this tumor cells identified

when we analyzed the expression of HER2 protein, 61.90%

chemotherapy resistant patients [44].

of the CK+/ CTCs showed overexpression (63.33% if we also counted CK-/CTCs). This patient we re scored a s HER2+ CTCs (more than 10% of CTCs w ere HER2+), some studies showed that evaluation of only 10 CTCs could indicate the patient´s HER2 status [26, 38, 39].

In non-metastatic colon cancer patients, analysis of CTCs in peripheral blood before surgery or che motherapy treatment rendered a similar percentage to the one found here. Wind et al. (2009) te sted the detection of CT Cs in P B and portal

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blood in different sets of samples in 31 non-metastatic colon

(such as trastuzumab) is not y et approved for colon can cer,

cancer patients at different ti me points: before tumor´s

clinical trials are underway to test its efficacy in the selected

mobilization, after tu mor´s mobilization and post-surgery.

small population of HER2+ patients.

This report sh owed a CT Cs detection rate of 4%-7% in peripheral blood vs. 26%-54 % in portal bl ood, depending on when blood samples was obtained, and described no correlation

between

tumor

cells det

ection

and

clinicopathologic characteristics or dise ase progression. Thorsteinsson et al. (2011) fou nd that 5% of sa mples (1/20 non-metastatic colon cancer patients) before surgery were positive for CTCs whereas samples taken after surgery were negative. This study reported no correlation between CTCs detection and the tu mor characteristics, PFS or OS.

Due to CTCs are on e of t he sources of the metastatic disease´s origin [46, 47] and that g enetic changes accompany tumor progre ssion may occur before the recurrence is detected [26, 38]. We hypothesize that CTCs´ genotype and phenotype analyses could complete the real status of the disease. Therefore, CTCs´ evaluation should be considered in the clinical practice.

Conclusions

Therefore, our results suggest that basal levels of CTCs (or

The conclusions from our study are as follows: (i)

CK+/CTCs) in non- metastatic colon canc er patients may

individualized CTCs analysis using the technique described

have no prognostic value, although further studies with

in the present article may provide additional information to

larger series of patients should be carried out to address this

conventional pathological diagnosis; (ii) chr omosome 17

issue.

triploidy and HER2 overexpression can appe ar in CTCs of early stages colon cancer patients.

Cohen et al. (2006) theorized that colorectal c ancer biology could play an im portant role in CTCs´ recov ery, since thi s

Authors’ contributions

type of cancer disse minated more frequently via portal

MC, RL, JJ, RM, FW, CS-Q, MD and JJG (all authors)

blood than other epithelial tumor which disseminated via

participated in the design of t he study. MC perfor med the

peripheral blood such as breast and pro state cancer. Thus,

immunohistochemical

these authors suggested that metastatic colorectal cancer

evaluated

patients might be less likely to have CT Cs in peripheral

interpretation, and wrote the manuscript. RL performed

blood than metastatic breast or prostate ca ncer patients.

primary tumor evaluation and interpretation of the results. JJ

Consequently, in non- metastatic patients it would be more

and RM contributed to patients´ admission and their follow-

noted. For exam ple, Wind et al. (2009) det ected a higher

up. MD-R contributed to statistical evaluation of the results.

percentage of non- metastatic colon canc er patients wit h

FW, CS-Q, AC and JJG revised the manuscript. JJG devised

CTCs in portal than in peripheral blood (54%; 31%; 45% in

and directed th e study. All authors read and approved the

portal blood vs. 7%; 4%; 4

final manuscript.

% in peripheral blood, these

the

and FICTION

results,

photography

techniques

and

acquisition

and

samples were taken before tu mor´s mobilization, after tumor´s mobilization or post-surgery, respectively). In the patient where we foun d gain of chrom osome and HER2 overexpression in CTCs, we may speculate that thi s would confer metastatic advantage. In breast cancer, it has been previously reported that HER2 overex pression can b e acquired during tumor progression: CTCs m ay express

Competing interests Authors declare that th ere are no financi al interests in relation to the work described.

Acknowledgments This study was supported by the “Fundación de Investigación Médica Mutua Madrileña” (to JJ Gaforio).

HER2 although their pri mary tumor was considered as HER2 negative [26-28]. The d etection of these CTCs with

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Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Capítulo 4 Resumen global de los resultados

153

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Resultados del trabajo experimental del capítulo 1 1.1. Mejora del rendimiento del enriquecimiento de células

tumorales

circulantes

empleando

una

centrifugacion en doble gradiente de densidad El primer paso para desarrollar la técnica de enriquecimiento celular fue comprobar en que fracción de células nucleadas, fracción mononuclear (MNC) o fracción granulocítica (GC), de la sangre periférica sedimentaban, preferentemente, las células tumorales de cáncer de mama. Para esto se realizaron varios controles positivos que fueron procesados de la siguiente forma: sangre periférica de voluntarios sanos que fue mezclada con un número variable (3.000; 1.000; 500; y 50 células) de células tumorales de 3 líneas celulares de cáncer de mama (MCF-7, MDA-MB-231 o T47D); las muestras de sangre mezcladas con las células tumorales fueron centrifugadas utilizando un doble gradiente de densidad (HISTOPAQUE-1119 y -1077, Sigma-Aldrich) para obtener, de esta forma, las fracciones MNC y GC; posteriormente, cada fracción celular fue recogida y procesada de forma individual para el enriquecimiento inmunomagnético de las células tumorales y su detección por inmunocitoquímica (ICC) (Figura 1a). Una vez terminado este procesamiento, se observó que aunque la mayor parte de células tumorales sedimentaban en la fracción MNC (Figura 2), existían células tumorales que sedimentan en la fracción GC.

155

Trabajo experimental y Resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

FIGURA 1. Células CK+ (flecha negra) detectadas por inmunocitoquímica. (a) Sangre de un voluntario sano mezclada con células tumorales MDAMB-231. El rango de recuperación celular, empleando el doble gradiente de densidad y el enriquecimiento inmunomagnético, fue del 60% al 80%. Estos cálculos fueron realizados en base al número total de células tumorales añadidas a las muestras sanguíneas de voluntarios sanos.

FIGURA 2. Recuperación de células tumorales de (a) fracción MNC y (b) fracción GC, tras mezclar muestras sanguíneas de voluntarios sanos con 3.000, 1.000, 500 y 50 células. Cada fracción celular fue procesada de forma separada. Tras el enriquecimiento inmunomagnético, las células tumorales fueron detectadas por inmunocitoquímica. Los experimentos se realizaron por triplicado y los resultados que se muestran son las medias de los triplicados y el rango de células tumorales recuperadas.

b) 100

Recuperación de células tumorales (% según células añadidas)

Recuperación de células tumorales (% según células añadidas)

a)

75 50 25 0 MCF-7

MDA-MB-231

T47D

100

3.000 + 1.000 500

75

50

50 25 0 MCF-7

MDA-MB-231

T47D

Para confirmar que existían células tumorales que aparecían en la fracción GC, se realizó un ensayo que consistía en el análisis por citometría de flujo de las fracciones de células nucleadas por separado. Para esto se mezcló sangre periférica de voluntarios sanos con un número

156

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

variable de células tumorales (3.000 y 1.000 células) de dos líneas celulares humanas de cáncer de mama (MCF-7 o MDA-MB-231). Estas muestras fueron centrifugadas usando el doble gradiente de densidad (HISTOPAQUE- 1119 y -1077) y se recogieron las fracciones MNC y GC. A partir de aquí, cada fracción celular fue procesada de forma separada, y se

realizó

el

marcaje

con

anticuerpos

monoclonales

(mAbs)

anti-CD45-Quantum Red (clon: BRA-55, Sigma), el cual reacciona frente a células

hematopoyéticas,

pero

no

con

células

tumorales;

y anti-Ber-EP4-FITC (clon: Ber-EP4, Dako), este mAb reacciona frente a dos glicopéptidos (peso molecular de 34 y 39 KDa) que son expresados por las células tumorales de mama, pero no en las células hematopoyéticas. Tras esta marcación las muestras fueron analizadas por citometría de flujo, donde las células tumorales fueron detectadas como células Ber-EP4 positivas y CD45 negativas. Al igual que antes, se observó que aunque la mayor parte de las células tumorales sedimentaban en la fracción MNC aparecía una fracción de éstas que sedimentan en la fracción GC (Tabla II).

1.2. Eficacia y especificidad del método Cuando se aplica el doble gradiente de densidad (HISTOPAQUE1119 y -1077) y el enriquecimiento inmunomagnético positivo de células tumorales, se obtiene una recuperación celular del 60% al 80%, estos cálculos fueron realizados en base al número total de células tumorales añadidas a las muestras sanguíneas de voluntarios sanos. La detección de células CK+ se realizó por ICC, procedimiento que está descrito en materiales y métodos. En los controles negativos, sangre periférica de voluntarios sanos, no se detectaron células CK+ en ninguno de ellos.

157

Trabajo experimental y Resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

TABLA II. Detección por citometría de flujo de células Ber-EP4-positivas y CD451 negativas en los experimentos de recuperación celular . Células MCF7 mezcladas en 5 ml de sangre periférica (n)

Células MDA-MB-231 mezcladas en 5 ml de sangre periférica (n)

3000

1000

3000

1000

Recuperación de células tumorales en la fracción MNC (%)

47

49

53

55

Recuperación de células tumorales en la fracción GC (%)

6

5

7

6

1

Los resultados que se muestran son las medias de experimentos realizados por triplicado

1.3. Correlación de células CK+ en sangre periférica con las características clinicopatológicas Las células CK+ de las muestras sanguíneas de los pacientes con cáncer de mama, fueron detectadas por ICC, y mostraron un patrón de marcación citoplasmático fuerte. Estas células estaban rodeadas por células hematopoyéticas que no presentaban expresión de CKs (Figura 1b, c). En la Tabla I aparece la correlación entre la presencia de células CK+ en sangre periférica y las características de los pacientes. Los estadísticos que se aplicaron fueron: para la asociación ordinal de variables, el test exacto de Fisher (valores p); y para el análisis de tendencia de las variables, el estadístico de Pearson o la prueba de la Chi cuadrado. La población de estudio fue de 92 pacientes con cáncer de mama, neoadyuvantes (25); adyuvantes (42); y metastásicos (25). Las características de la población eran: edad media de la población de 55 años (rango = 26-77 años), donde el 64% de los pacientes eran mayores de 50 años; 54 pacientes (59%) postmenopáusicas; el estadio tumorales

158

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

más común fue el T2 (47%), seguido de los tumores T1 (20%) y los estadios T3 y T4 representaron el 27% de la población; el 74% de los pacientes presentó nódulos linfáticos positivos; y el cáncer ductal (70%) fue el tipo histológico más frecuente. FIGURA 1. Células CK+ (flechas negras) detectadas por inmunocitoquímica. (b, c) Sangre periférica de dos pacientes con cáncer de mama. Las fracciones celulares fueron sometidas a un proceso de enriquecimiento y selección inmunomagnética, tras el cual fueron marcadas con el mAb CKs 7/8 CAM5.2. Las células CK+ presentaron un patrón de marcación citoplasmático fuerte, y aparecen rodeadas por células hematopoyéticas que no expresan CKs.

Las células CK+ fueron identificadas en 57 de los 92 (62%) pacientes con cáncer de mama, con un rango de 1-61 células (media = 8). Aparecieron diferencias significativas en la presencia de células CK+ de acuerdo a la expresión del receptor de estrógenos (ER) (p=0,049) y los nódulos linfáticos (p=0,033), pero no con las demás características estudiadas. Aunque, sí que se observó una tendencia significativa que estaba en el límite, entre la presencia de células CK+ y el tamaño tumoral (p=0,07).

159

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

TABLA I. Relación entre las características y biomarcadores de los pacientes con la 1 detección de células CK-positivas en sangre periférica. Significado estadístico. Características y biomarcadores de los pacientes Nº de pacientes Edad (años) ≤50 >50 Estado menopáusico Premenopáusica Postmenopáusica Tipo de paciente Neoadyuvante Adyuvante Metastásico T (Tamaño tumor) T1 T2 T3 T4 Tx N (Estado nódulos linfáticos) N0 N+ Nx M (Metástasis a distancia) M0 M1 Mx Estadificación TNM I II III IV Tipo histológico Ductal Lobular Otros ER (Receptor de estrógenos) + PgR (Receptor de progesterona) + cerbB-2 + p53 + Ki67 + -

160

Pacientes CK+ n (%) 57 (62,0)

Pacientes CKn (%) 35 (38,0)

21 (63,6) 36 (61,0)

12 (36,4) 23 (39,0)

22 (57,9) 35 (64,8)

16 (42.1) 19 (35,2)

17 (68,0) 24 (57,1) 16 (64,0)

8 (32,0) 18 (42,9) 9 (36,0)

9 (50,0) 27 (62,8) 5 (62,5) 13 (76,5) 3 (50,0)

9 (50,0) 16 (37,2) 3 (37,5) 4 (23,5) 3 (50,0)

5 (33,3) 47 (69,1) 5 (55,6)

10 (66,7) 21 (30,9) 4 (44,4)

34 (61,8) 16 (64,0) 7 (58,3)

21 (38,2) 9 (36,0) 5 (41,7)

2 (33,3) 25 (64,1) 14 (63,6) 16 (64,0)

4 (66,7) 14 (35,9) 8 (36,4) 9 (36,0)

38 (59,4) 9 (69,2) 10 (66,7)

26 (40,6) 4 (30,8) 5 (33,3)

40 (69,0) 11 (44,0)

18 (31,0) 14 (56,0)

34 (63,0) 13 (52,0)

20 (37,0) 12 (48,0)

40 (61,5) 8 (61,5)

25 (38,5) 5 (38,5)

22 (66,7) 27 (62,8)

11 (33,3) 16 (37,2)

29 (59,2) 5 (62,5)

20 (40,8) 3 (37,5)

Valor-p 0,827 0,521 0,679

0,07

0,0331

1,000

0,543

0,802

0,0491 0,461 1,000 0,559 0,897

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

1.4. Análisis pronóstico Las figuras 3 y 4 muestran los análisis de Kaplan-Meier de la supervivencia libre de progresión (o tiempo libre de progresión) y la supervivencia global dependiendo de la detección de células CK+, respectivamente. Los datos de seguimiento fueron tomados desde el momento de la última cita clínica o la fecha de la muerte (tiempo medio de seguimiento = 21 meses; rango = 2-31 meses). Los datos completos de seguimiento se obtuvieron de 90 pacientes. Los análisis estadísticos (análisis Kaplan-Meier) mostraron que la detección de células CK+ en sangre periférica estaba correlacionada positivamente con la progresión de la enfermedad (p=0,058). Veintiséis pacientes desarrollaron progresión de la enfermedad en el periodo de seguimiento, 20 de estos pacientes presentaban células CK+ en sus muestras sanguíneas. Además, y sorprendentemente, los datos de correlación entre la presencia de células CK+ y la supervivencia muestran que, de los 90 pacientes a los que se les realizó el seguimiento completo, 11 de ellos murieron y todos presentaban células CK+ en sangre periférica. De forma contraria, todos los pacientes sin células CK+ continuaban con vida en el momento de la evaluación. De esta forma, el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier mostró que la presencia de células CK+ en sangre periférica estaba asociada a una supervivencia de la población más corta (p=0,003).

161

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Tiempo libre de enfermedad (PFS)

Figura 3. Curva Kaplan-Meier para el tiempo libre de enfermedad (PFS) en 26 pacientes según la detección de células CK+. En el grupo CK-negativo hay 6 pacientes (línea roja) y en el grupo CK+ hay 20 (línea azul). El PFS fue calculado desde la fecha de la detección de células CK+ en sangre periférica hasta la fecha de progresión clínica o patológica.

1,00

CK-negativo 0,75

CK-positivo

p=0,058

0,50

0,25

0,00 0

10

20

30

Tiempo (meses)

Figura 4. Curva Kaplan-Meier para la supervivencia global (OS) en 90 pacientes según la detección de células CK+. En el grupo CK-negativo hay 34 pacientes (línea roja) y en el grupo CK+ hay 56 (línea azul. La OS se refiere a la supervivencia con o sin recurrencia de la enfermedad.

CK-negativo

Supervivencia global (OS)

1,00

0,75

CK-positivo p=0,003

0,50

0,25

0,00 0

162

10

20

Tiempo (meses)

30

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Resultados del trabajo experimental del capítulo 2 2.1. Eficiencia del método de inmunoselección de células tumorales (TCs) La recuperación celular, para las tres líneas celulares estudiadas, estuvo en torno al 60%-80% (Tabla 1), este rango es muy similar al descrito

en

los

resultados

del

trabajo

se

publicó

en

2003

[Gaforio y cols., 2003]. El patrón de marcación citoplasmático, de todas las células tumorales [células citoqueratina positivas (células CK+)], fue fuerte; además, las células tumorales presentaron una morfología celular que era coherente con una morfología de fenotipo maligno (Figura 1A, C). Aunque las células tumorales eran inmunoseleccionadas específicamente, en la fracción positiva aparecieron algunas células hematopoyéticas (Figura 1A, C), hecho descrito en trabajos anteriores. La inmunofenotipación de las células tumorales fue llevada a cabo con un anticuerpo de ratón anti-CKs humanas, seguido por una marcación en cascada de dos anticuerpos fluorescentes (Alexa Fluor 350 ratón antihumano y Alexa Fluor 350 cabra anti-ratón). Este procedimiento presentó una marcación excelente en las células tumorales de las tres líneas analizadas (Figura 1D, F).

163

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

2.2. Análisis FICTION (“Fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics as a tool for investigation of neoplasm”) de las TC seleccionadas Las células de cáncer de mama fueron inequívocamente distinguibles de las células hematopoyéticas por la fluorescencia azul que mostraron, esto fue debido a la marcación que se empleó (Figura 2A, C); además, la morfología de las tres líneas celulares apareció bien conservada (Figura 2A, C). La hibridación de la sonda génica, para ERBB2, TOP2A y el centrómero 17 (CEP17), fue claramente observada en la células tumorales y los leucocitos (Figura 2A, F) de las muestras. Los leucocitos presentaron dos señales para ambos genes y el centrómero, y sirvieron de control interno para la hibridación. En la Tabla 2 podemos observar los resultados cuantitativos de las señales encontradas en las células tumorales. En las células MCF-7, el patrón génico más común encontrado fue la presencia de tres copias del CEP17 y dos copias del gen ERBB2 (media de 2,02 ± 0,24 copias por célula) y dos copias del gen TOP2A (media de 2,01 ± 0,26 copias por célula; Figura 2D; Tabla 2). En el caso de las células MDA-MB231, se observó que existían dos patrones de marcación génica: un patrón predominante (91,33% de las células MDA-MB-231) que era trisómico para el cromosoma 17; y otro patrón que presentaba una tetrasomía para este cromosoma (8,67% de las células tumorales). En general, ninguna de estas poblaciones celulares presentó amplificaciones o deleciones de los genes, ERBB2 o TOP2A (la relación media de los genes con respecto al CEP17 fue de 1,01 para ambos; Tabla 1). La línea celular SK-Br-3 presentó muchas señales para ERBB2, TOP2A y CEP17 (Figura 2F). El número medio de copias para el gen ERBB2 fue de 25,87 ± 7,39, mientras que para el gen

164

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

TOP2A fue de 9,48 ± 2,55 copias. Esta línea celular presentaba amplificación del gen ERBB2 (3,81 veces en relación al CEP17). En los controles negativos que se realizaron, no apareció señal azul (células CK+) ni señales de hibridación génica. Figura 1. Líneas celulares tumorales mezcladas con sangre periférica de voluntarios sanos. Las fracciones de células mononucleares y granulocíticas son procesadas por un enriquecimiento inmunomagnético y detectadas utilizando inmunocitoquímica (A-C) o inmunofluorescencia (D-F). Las células tumorales [MCF-7 (A, D), MDA-MB-231 (B, E), y SK-Br-3 (C, F)], muestran un patrón de marcaje citoplasmático sólido, y aparecen rodeadas de células hematopoyéticas que no están marcadas (barra de escala = 75 µm).

165

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Figura 2. Sangre periférica de voluntarios sanos mezclada con diferentes líneas celulares tumorales. Las muestras son procesadas por un enriquecimiento inmunomagnético seguido de la técnica FICTION. Los leucocitos que aparecen en las muestras son negativos para la marcación con CK y sirven de control interno para la hibridación in situ fluorescente (FISH). Las células tumorales [MCF-7 (A,D), MDA-MB-231 (B,E), y SK-Br-3 (C,F)] son claramente identificables y muestran señales de hibridación para ERBB2 (HER2/neu) (verde), TOP2A (naranja), and CEP17 [aqua (azul claro)]. (D) Las células MCF-7 presentan tres copias del cromosoma 17 y dos copias de los genes ERBB2 y TOP2A (media: 2 copias de ambos genes por célula). (E) El patrón más común de las células MDA-MB-231 presenta tres señales parar CEP17, ERBB2 y TOP2A. (F) Las células SK-Br-3 poseen un alto nivel de amplificación de ERBB2 y un bajo nivel de amplificación para TOP2A. Se observan varias señales de hibridación para el CEP17. No todas las señales de los genes se encuentran en foco al mismo tiempo (barra de escala = 75 µm).

166

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

TABLA 1. Rangos de recuperación de células tumorales en sangre periférica.

Rangos de recuperación

a

Nº de CT recuperadas en la M1

Nº de CT recuperadas en la M2

Nº de CT recuperadas en la M3

% total de recuperación

SK-BR-3

780

760

751

76,37

MCF-7

681

733

742

71,87

MDA-MB-231

670

657

622

64,97

Línea celular

a

Para determinar el número de células tumorales recuperadas, se mezclaron 1.000 células de líneas de cáncer de mama [MCF-7, MDA-MB-231 o SK-Br-3] con 10 ml de sangre periférica de 9 voluntarios sanos. Capítulo 2: Materiales y Métodos, Análisis de recuperación celular. CT = Células tumorales; M = Muestra.

Tabla 2. Número absoluto y relativo de copias de los genes ERBB2 (HER2/neu) y TOP2A, en las células SK-Br-3, MCF-7, y MDA-MB-231, tras la separación inmunomagnética de sangre y el análisis FICTION.

Línea celular

Número copias de ERBB2 (HER2/neu) Absoluto Relativo al (media ± SD) CEP 17

Número copias de TOP2A Absoluto (media ± SD)

Relativo al CEP 17

2,00 ± 0,00

1,00

a

LEUCOCITOS

2,00 ± 0,00

1,00 b

3,81

b

1,40

SK-BR-3

25,87 ± 7,39

MCF-7

2,02 ± 0,24

0,66

c

2,01 ± 0,26

0,66

MDA-MB-231

3,09 ± 0,28

1,01

3,09 ± 0,28

1,01

9,48 ± 2,55

c

a

Control interno de las muestras, 450 células. Amplificación génica. c Deleción génica. Por cada tipo celular se han evaluado ciento cincuenta células tumorales (50 células tumorales por muestra). CEP = Centrómero; SD = Desviación media. b

167

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Resultados del trabajo experimental del capítulo 3 3.1. Detección de células tumorales circulantes con expresión de citoqueratinas (CK+/CTCs) en pacientes con cáncer de colon Se evaluó la presencia de CK+/CTCs en 33 muestras sanguíneas de pacientes con cáncer de colon no metastásico consecutivos. Los controles negativos empleados fueron las extracciones sanguíneas de 3 pacientes con diverticulosis y de seis voluntarios sanos. En ninguno de estos controles negativos se detectó presencia de CK+/CTCs. Los resultados de la Tabla 1, muestran como estadísticamente no se encontró asociación entre la presencia de CK+/CTCs y las variables estudiadas en la población de pacientes con cáncer de colon no metastásico. En 3 pacientes de los 33 analizados, se detectaron CK+/CTCs (9,09% de la población), con un número medio de CK+/CTCs aisladas, en estos 3 pacientes, de 9,67 células tumorales (rango de 1-26 células CK+). No se encontró asociación entre la presencia de CK+/CTCs y la supervivencia global de la población (OS) y/o el tiempo libre de enfermedad

(PFS)

(media

rango = 0,5-29,9 meses).

168

de

seguimiento

=

13

meses;

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Tabla 1. Correlación entre la presencia de CK+/CTCs y las variables clínicopatológicas de los pacientes.

Variables clínicopatológicas Género Hombre Mujer Localización del tumor Colon ascendente Colon transverso Colon descendente Colon sigmoide Colon transverso-sigmoide Grado de diferenciación Bien Moderado y moderado-pobre Pobre TNM 0 I II III Tipo histológico Adenocarcinoma Adenocarcinoma mucinoso Adenocarcinoma intramucoso Configuración tumoral Excrecente Excrecente-infiltrativo Infiltrativo Poliploide Ulcerativo Ulcero vegetativo Vegetativo Invasión tumoral Linfática + Venosa + Perineural + -

Número de CK+/CTCs/10ml

Valor p

Pacientes CK+ (%)

Pacientes CK - (%)

2 (6,06%) 1 (3,03%)

20 (60,60%) 10 (30,30%)

2 (6,06%) 0 (0,00%) 0 (0,00%) 1 (3,03%) 0 (0,00%)

12 (36,36%) 1 (3,03%) 12 (36,36%) 4 (12,12%) 1 (3,03%)

2 (6,06%) 0 (0,00%) 1 (3,03%)

10 (30,30%) 13(39,39%) 5 (15,15%)

0 (0,00%) 0 (0,00%) 1 (3,03%) 2 (6,06%)

2 (6,06%) 3 (9,09%) 10 (30,30%) 15 (45,45%)

3 (9,09%) 0 (0,00%) 0 (0,00%)

26 (78,78%) 2 (6,06%) 2 (6,06%)

0 (0,00%) 0 (0,00%) 1 (3,03%) 0 (0,00%) 1 (3,03%) 1 (3,03%) 0 (0,00%)

6 (18,18%) 1 (3,03%) 7 (21,21%) 5 (15,15%) 1 (3,03%) 9 (27,27%) 1 (3,03%)

2 (6,06%) 1 (3,03%)

15 (45,45%) 15 (45,45%)

0,523

0 (0,00%) 3 (9,09%)

3 (9,09%) 27 (81,81%)

0,744

1 (3,03%) 2 (6,06%)

8 (24,24%) 22 (66,67%)

0,629

0,718

0,477

0,289

1,000

1,000

0,501

169

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

En cuanto a los tres pacientes con CK+/CTCs en sus muestras, en uno

de

ellos

la

detección

de

CK+/CTCs

fue

realizada

por

inmunocitoquímica y presentó una única CK+/CTC con una marcación citoplasmática fuerte, rodeada por células hematopoyéticas que no presentaban expresión de CKs (resultado que no se muestra). Las características genéticas de esta CK+/CTC no pudieron ser estudiadas por problemas técnicos. Las otras dos muestras fueron analizadas por FICTION, y los resultados se muestran en la sección de Análisis FICTION en las CK+/CTCs inmunoseleccionadas.

3.2. Caracterización de las líneas celulares tumorales por FICTION y expresión de HER2 Lo primero que se realizó fue la caracterización, por la técnica FICTION, de las células de líneas tumorales (SK-Br-3, Caco-2, HT-29, MCF-7 y MDA-MB-231) mezcladas con sangre periférica de voluntarios sanos (controles positivos). En los controles positivos, las células tumorales fueron inequívocamente distinguibles de las células hematopoyéticas, debido a la marcación fluorescente azul (CK+) que presentaban (Figura 1). En estas muestras, también, eran claramente observables las señales de hibridación del gen ERBB2 y del CEP17, para ambos tipos celulares (células tumorales y leucocitos) (Figura 1). Todos los leucocitos presentaron dos señales del gen y del centrómero, lo que sirvió de control interno de la hibridación. Para la evaluación de la inmunomarcación con anti-HER2 se analizaron: los cinco controles positivos (SK-Br-3, Caco-2, HT-29, MCF-7 y MDA-MB-231) y el control negativo de SK-Br-3 (en el cual se sustituyó el

170

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

anticuerpo primario por agua destilada), todos estos controles habían sido procesados previamente siguiendo el protocolo de FICTION. Los resultados mostraron un patrón de expresión diferente en cada control positivo (Figura 1). Las líneas SK-Br-3, Caco-2 y HT-29, mostraron una marcación fuerte (evaluada como 3+). Las células tumorales MCF-7 presentaron una marcación moderada (evaluada como 2+) y la línea MDA-MB-231 fue negativa para la expresión de HER2.

171





Figura 1. Imágenes en fluorescencia (objetivo 100X) de diferentes líneas celulares tumorales (HT-29, Caco-2, SK-Br-3, MCF-7 and MDA-MB-231) mezcladas con sangre periférica de voluntarios sanos, muestras procesadas por enriquecimiento inmunomagnético y FICTION (barra de escala: 12,32 µm). La columna “Citoqueratina” muestra la marcación con CK de las células tumorales, las cuales se identifican claramente por su fluorescencia azul, evaluación realizada por microscopia de fluorescencia. Las columnas “Cromosoma 17” y “ERBB2” muestran las señales de hibridación para el CEP17 y el ERBB2 (HER2/neu) respectivamente (sobreposición de diferentes planos), evaluación realizada por microscopia confocal. La columna “Fotomontaje” muestra la sobreposición de las columnas “Citoqueratina” (azul), “Cromosoma 17” (aqua o azul claro) y “ERBB2” (verde). La columna “Transmitida” muestra la morfología de las células, analizado por microscopia confocal. La expresión de la proteína HER2 aparece en la última columna “HER2”, estas células son diferentes a las fotografiadas en las otras columnas.

Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Trabajo experimental y resumen global de los resultados



.

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

3.3.

Análisis

FICTION

en

las

CK+/CTCs

inmunoseleccionadas Los criterios de identificación de CK+/CTCs consistieron en que fueran: células nucleadas, positivas para la marcación de CKs (células CK+) con fluorescencia azul. Los resultados fueron expresados en número de CK+/CTCs por 10 ml de sangre periférica. Para comprobar la eficiencia de la hibridación génica se evaluaron unas 50 células normales (leucocitos contaminantes), como mínimo, por muestra. Estos leucocitos eran células morfológicamente intactas y cuyos núcleos no estaban sobrepuestos, y se utilizaron como control interno de la hibridación. Paciente con número de identificación (IN) 21: En este paciente se localizaron 2 células intactas detectadas como CK+/CTC. La evaluación genética de estas células tumorales demostró que eran disómicas para el cromosoma 17 y que presentaban dos copias del gen ERBB2 (resultado que no se muestra). Paciente IN28: En este paciente se encontraron un total de 26 CK+/CTCs intactas. De estas 26 CK+/CTCs detectadas, 23 de ellas presentaron polisomía (trisomía) para el cromosoma 17 (88,46%) y 3 CK+/CTCs presentaron disomía para este cromosoma (11,54%) (Tabla 2). El número medio de copias del CEP17 en estas CK+/CTCs fue de 2,88 copias por célula. En 20 de estas 26 CK+/CTCs fue posible evaluar el número absoluto de copias del gen ERBB2: 4 de las 20 células tumorales presentaron 3 copias del gen (20%) y 16 de ellas presentaron 2 copias del gen (80%). En resumen podemos decir que no se encontró amplificación del gen. El estado del gen ERBB2 en estas CK+/CTCs fue de 2,20 copias por

174

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

célula. En la figura 2 se muestra un ejemplo representativo del estado del gen ERBB2 y del cromosoma 17 en las CK+/CTCs aisladas. Tabla 2. Aneusomía del cromosoma 17 de acuerdo a la expresión de la proteína HER2 en CK+/CTCs del paciente IN28. Aneusomía

Nº CK+/CTC

% CK+/CTC

Trisomía

23

88,46

Disomía

3

11,54

CK+/CTC totales

26

Expresión de la proteína HER2 0

1+

Nº de 0 8 CK+/CTC % de 0 42,11 CK+/CTC Nº de 0 0 CK+/CTC % de 0 0 CK+/CTC Nº de 0 8 CK+/CTC % de 0 38,09 CK+/CTC

2+

3+

2+/3+

CK+/CTC totales

5

6

11

19

26,32

31,58

57,89

2

0

2

100

0

100

7

6

13

33,33

28,57

61,90

2

21

175



Figura 2. Imágenes en fluorescencia (objetivo 100X) de las CK+/CTCs aisladas de sangre periférica del paciente IN28 (barra de escala: 12,32 µm). La columna “Citoqueratina” muestra la marcación con CK de las células tumorales, las cuales se identifican claramente por su fluorescencia azul, evaluación realizada por microscopia de fluorescencia. Las columnas “Cromosoma 17” y “ERBB2” muestran las señales de hibridación para el CEP17 y el ERBB2 (HER2/neu) respectivamente (sobreposición de diferentes planos), evaluación realizada por microscopia confocal. La columna “Fotomontaje” muestra la sobreposición de las columnas “Citoqueratina” (azul), “Cromosoma 17” (aqua o azul claro) y “ERBB2” (verde). La columna “Transmitida” muestra la morfología de las células CK+, analizada por microscopia confocal. La expresión de la proteína HER2 aparece en la última columna “HER2”. Todas las CK+/CTCs son las mismas en las diferentes columnas.

Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Trabajo experimental y Resumen global de los resultados



Trabajo experimental y Resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

3.4. Expresión de la proteína HER2 en las CTCs Solamente se pudo realizar la evaluación de la expresión de la proteína HER2 en 21 de las 26 CK+/CTCs aisladas en el paciente IN28. Trece de estas 21 CK+/CTCs (61,90%) presentaron sobreexpresión de la proteína; 6 CK+/CTCs presentaron una marcación 3+; y 7 una marcación 2+. Ocho CK+/CTCs (38,10%) presentaron una marcación suave de membrana y fueron evaluadas como negativas para la expresión de HER2. Las 5 CK+/CTCs restantes de las 26 CK+/CTCs aisladas en la muestra, no fueron evaluables. En la figura 2 se muestra un ejemplo representativo de la expresión de la proteína HER2 en las CK+/CTCs aisladas. Además de estas 21 CK+/CTCs se encontraron 9 células que eran negativas para la expresión de las CKs estudiadas (CK-/CTCs), pero que el examen histopatológico determinó que eran células tumorales. De estas 9 CK-/CTCs la sobreexpresión de HER2 fue detectada en 6 células tumorales (marcación 3+) y las otras 3 células tumorales presentaron una marcación suave, que fue anotada como negativa para la expresión de HER2 (Figura 3). En resumen, 19 (13 CK+/CTCs y 6 CK-/CTCs) CTCs presentaron sobreexpresión de HER2 (63,33%) y 11 (8CK+/CTCs y 3 CK-/CTCs) CTCs no presentaron expresión de la proteína (Figura 3).

3.5. Immunohistoquímica e hibridación fluorescente in situ (FISH) del tumor primario del paciente IN28 Debido a los resultados que se obtuvieron en las CTCs del paciente IN28, se realizó un estudio más completo de su tumor primario. El examen histológico reveló un adenocarcinoma infiltrativo (Figura 4) sin nódulos positivos ni metástasis a distancia (seguimiento hasta el 15 de Abril de 2008). Las muestras marcadas con hematoxilina & eosina

178

Trabajo experimental y resumen global de los resultados Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

mostraron un alto grado de agresividad tumoral (Figura 4A, B). Este tumor primario presentó una marcación fuerte para Ki67 (hasta un 90% de las células estaban teñidas) (Figura 4E), ciclina D1 (aproximadamente el 50%) (Figura 4G), con una expresión casi nula para p53 (Figura 4F) y no expresión de HER2 (Figura 4H). En él aparece una microvasculatura bien desarrollada, demostrada por la inmunomarcación con CD31 y CD34 (Figura 4C, D respectivamente), y presencia de células tumorales dentro de los vasos pequeños. El análisis FISH se realizó en dos secciones diferentes del tumor primario, demostrando ambas no amplificación del gen ERBB2 y un patrón disómico para el cromosoma 17 (resultado que no se muestra). Los resultados e expresión de HER2 y el análisis FISH del tumor primario concuerdan entre sí, pero no con los resultados obtenidos en las CK+/CTCs de este paciente. Figura 3. Expresión de HER2 en las CK-/CTCs (objetivo de 100X) del paciente IN28. La evaluación de la marcación de la proteína HER2 aparece en la esquina inferior derecha de las imágenes (barra de escala: 12,32 µm).

179

Figura 4. Características histopatológicas del tumor primario del paciente IN28. (A) Glándulas neoplásicas con un patrón de crecimiento infiltrante que afecta a la capa muscular propia del intestino. Marcación Hematoxilina& Eosina, objetivo 10X. (B) Detalle de las glándulas neoplásicas, atípicas pero bien conformadas, aunque hay glándulas fusionadas presentes. Tener en cuenta la presencia de invasión (señalada por la flecha) linfovascular (pequeños vasos). Marcación Hematoxilina& Eosina, objetivo 40X. (C-G) Expresión inmunohistoquímica de marcadores que definen molecularmente este tumor, se muestra una gran densidad microvascular por la inmunotinción con CD31 (C) y CD34 (D). Las flechas señalan pequeños vasos con invasión. Alto índice proliferativo (Ki67) (E), baja expresión de p53 (F), alta expresión de ciclina D1 (G) y resultado negativo en el test Herceptest (H), para la expresión de la proteína HER2 (en la esquina inferior derecha de la última imagen se inserta un control positivo, carcinoma de mama intraductal, para el Herceptest). Todas las figuras: método Envision®, objetivo 20x.

Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Trabajo experimental y Resumen global de los resultados

DISCUSIÓN GENERAL

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

I. CARACTERÍSTICAS DEL ESTUDIO 1.

Recogida de datos Los datos clínicos y patológicos de los pacientes estudiados, se

obtuvieron de las historias clínicas generadas en los Servicios de Oncología Médica, Cirugía y Patología del Hospital Universitario de Jaén. El carácter retrospectivo de los estudios ha supuesto una limitación a la hora de la recogida de datos, tanto clínicos como patológicos, sobre todo en los pacientes metastásicos. En cuanto al seguimiento y la recogida de datos referidos a la evolución postoperatoria de los pacientes, han existido casos en los que la historia clínica no incluía referencias de la evolución, recidiva tumoral y/o muerte del paciente. Ésta fue solicitada al Servicio de Oncología Médica y, en algunos casos, la información fue requerida a los familiares mediante llamada telefónica.

2.

Población de pacientes y tiempo de seguimiento

1.2.1. Tipo de población En cáncer de mama se ha estudiado una población heterogénea de 92 pacientes, compuesta por: neoadyuvantes (25); adyuvantes (42) y metastásicos (25). Diecinueve (76%) de los pacientes metastásicos habían recibido un tratamiento previo de quimioterapia, que había terminado 24 semanas antes de la extracción sanguínea, y 6 (24%) de ellos no lo habían recibido, ya que eran pacientes recién diagnosticados como metastásicos en el momento de entrar en el estudio. El porcentaje de pacientes con CTCs es del 62% (57/92): 68,0% (17/25) neoadyuvantes; 57,1% (24/42) adyuvantes; y 64% (16/25) metastásicos, y el seguimiento que se realiza es de 21 meses (rango = 2-31 meses). 183

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

La mayor parte de los estudios publicados encuentran diferencias en los porcentajes de detección de CTCs entre pacientes metastásicos y no metastásicos [Cristofanilli y cols., 2004; Bidard y cols., 2008a; Bidard y cols., 2008b; Pierga y cols., 2008; Bidard y cols., 2010]. El hecho de que los resultados del primer trabajo experimental no muestren diferencias significativas, entre los pacientes metastásicos y los no metastásicos, se puede deber a que se ha incluido en el estudio una población heterogénea de pacientes metastásicos, es decir, pacientes que habían recibido un tratamiento previo de quimioterapia y pacientes que no lo habían recibido. Además, el porcentaje de detección de células CK+ en los pacientes no metastásicos, es superior al que otros autores indican [Pierga y cols., 2008; Bidard y cols., 2010]. En el caso de los pacientes con cáncer de colon, se ha estudiado una población más homogénea, compuesta por 33 pacientes no metastásicos de los cuales 17 (51,5%) presentaban nódulos linfáticos afectados (estadio III) y 16 (48,5%) no los presentaban (estadio 0-II). El porcentaje de pacientes con CTCs en sangre periférica es del 9,09% (3/33): 3,03% (1/11) en estadio II y 6,06% (2/17) en estadio III, y el seguimiento que se realizó fue de 13 meses (rango = 0,5-29,9 meses). Los estudios publicados presentan diferencias en los porcentajes de detección de CTCs entre pacientes metastásicos: del 26% al 75% [Cohen y cols., 2008; Molnar y cols., 2001], y no metastásicos: del 5% al 57% [Thorsteinsson y cols., 2011; Wong y cols., 2009]; pero además, la detección de CTCs en pacientes metastásicos es más baja que en otros tipos de tumores sólidos de origen epitelial [Cohen y cols., 2008;

184

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Cristofanilli y cols., 2004; Gaforio y cols., 2003]. Cohen y Terstappen indican en su investigación de 2006 [Cohen y cols., 2006], que esto se puede deber a la biología del cáncer colorrectal, ya que a diferencia de tumores como el cáncer de mama y el de próstata, éste se disemina preferentemente por la vena porta hepática (originando metástasis en hígado) antes que sistémica. De forma alternativa, esta hipótesis también podría explicar las diferencias de los porcentajes de detección de CTCs que existen entre los pacientes metastásicos y los no metastásicos con cáncer colorrectal. Hay que tener en cuenta que la fuente de CTCs en sangre periférica es tanto el tumor primario como las metástasis, y debido a que en cáncer colorrectal la diseminación del tumor primario es principalmente por la vena porta hepática, como se aprecia en el trabajo de Wind y cols. (2009) donde en tres momentos diferentes (intra-cirugía sin extirpación del tumor; intra-cirugía tras extirpación del tumor; y postcirugía) el porcentaje de pacientes con CTCs es de 7%; 4%; 4% en sangre periférica vs. 54%; 31%; 26% en sangre portal, serían las metástasis las responsables del mayor vertido de CTCs al torrente sanguíneo periférico. Muy pocos estudios se enfocan en la detección de CTCs en poblaciones de pacientes con cáncer colorrectal no metastásico [Sastre y cols., 2008; Maestro y cols., 2009; Wind y cols., 2009; Wong y cols., 2009; Thorsteinsson y cols., 2011]. Las características de estos trabajos son: el volumen de las muestras estudiadas es de 7,5 ml de sangre periférica en todos excepto en el trabajo de Wong y cols. (2009) donde se analizan 10 ml; el marcador de aislamiento de CTCs es la molécula de adhesión epitelial (EpCAM), el mAb anti-EpCAm utilizado es el clon HEA125 (reconoce un glicopéptido de peso molecular 34 KDa) en todos los trabajos excepto en el de Wong y cols. (2009) donde se utiliza el clon Ber-EP4 (reconoce dos glicopéptidos de peso molecular 34 KDa y

185

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

39 KDa); las CTCs son detectadas con anti-CKs 8/18/19, excepto en el trabajo de Wong y cols. (2009) donde se utilizó anti-CK20; y los porcentajes de pacientes que presentan células CK+ varían desde el 5% [Thorsteinsson y cols., 2011] al 57% [Wong y cols., 2009]. Para analizar mejor estos resultados podemos hacer una división entre estos trabajos según el momento en que se realiza la extracción sanguínea que se va a evaluar para la detección de CTCs: 1. Estudios en los que se evalúa si la presencia de CTCs en sangre periférica tras la cirugía y antes del tratamiento con quimioterapia tenía valor pronóstico. Maestro y cols. (2009) estudiaron una población de pacientes metastásicos y no metastásicos con cáncer de mama (438), de próstata (50) y colorrectal (197); y Sastre y cols. (2008) se enfocaron en una población de estudio de 97 pacientes recién diagnosticados con cáncer colorrectal. Los porcentajes de pacientes, con cáncer de colon no metastásico, con un número de CTCs ≥ 2 en 7,5 ml de sangre periférica son muy similares entre sí: 15,2% [Maestro y cols., 2009] y 26% [Sastre y cols., 2008]. En el estudio de Maestro y cols. (2009), las diferencias entre los porcentajes de pacientes que presentan un número de CTCs ≥ 2 en 7,5 ml de sangre periférica según el estadio tumoral son evidentes: 15,2% no metastásicos vs. 61,3% metastásicos. 2. Estudios en los que se evalúa si la presencia de CTCs en sangre periférica antes de cirugía tiene valor pronóstico. La población y la extracción sanguínea de estudio de estas investigaciones son iguales a las del tercer trabajo experimental de esta tesis, y los resultados obtenidos en dos de estos trabajos son similares a los expuestos en esta tesis: 186

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

a) Wind y cols. (2009) evaluaron si la detección de CTCs, en sangre periférica y portal, de 31 pacientes con cáncer de colon no metastásico tenía valor pronóstico. La toma de muestras se realizó en diferentes momentos: antes de cirugía; durante la cirugía; y justo al finalizar la operación. Este estudio muestra un porcentaje de pacientes del 6,7% (2 pacientes CK+ de los 31) con células CK+ en sangre periférica antes de cirugía, del 7% durante el acto operatorio y antes de extirpar el tumor, del 4% durante el acto operatorio y tras de extirpar el tumor y del 4% tras finalizar la cirugía. Los resultados en las muestras de sangre portal dan unos porcentajes de pacientes con células CK+ mayores (54%; 31%; y 26%, respectivamente, donde no existe extracción pre-cirugía), existiendo diferencias también si la operación fue realizada por laparoscopia o abierta. Sus resultados no presentaron ninguna correlación entre la presencia de CTCs en sangre periférica de estos pacientes y las características clinicopatológicas del tumor primario o la progresión de la enfermedad. b) Thorsteinsson y cols. (2011) comprobaron si la detección de CTCs antes y después de la cirugía, en sangre periférica, en 20 pacientes con cáncer de colon no metastásico tenía valor pronóstico. Este trabajo muestra un porcentaje de pacientes con células CK+ antes de cirugía del 5% (solamente un paciente CK+ de los 20 estudiados) y todas las muestras que se tomaron tras la cirugía resultaron ser negativas. Los resultados obtenidos en este estudio indican que no existe una correlación entre la detección

187

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

de CTCs y las características patológicas de los pacientes, la progresión de la enfermedad o la supervivencia. c) Wong y cols. (2009) analizaron si la detección de CTCs antes de cirugía o de la quimioterapia en 132 pacientes con cáncer colorrectal tenía valor pronóstico. De estos pacientes: 101 eran estadios I-III, y sus muestras sanguíneas se obtuvieron antes y después de la cirugía (5 días tras ésta); y 31 pacientes eran metastásicos, y sus muestras se obtuvieron pre-tratamiento. Los controles utilizados fueron 3 cohortes poblacionales diferentes: 30 pacientes con cáncer de mama, próstata, hígado y pulmón; 30 pacientes con enfermedades intestinales benignas; y 40 voluntarios sanos. En ninguna de estas cohortes control se detectaron CTCs (células CK20+), demostrando que este método de detección es específico para pacientes con cáncer colorrectal. Los resultados mostraron unos porcentajes de pacientes CK20+ por estadios de: 39% estadio I, 55% estadio II, 73% estadio II y 77% estadio IV. Utilizando un punto de corte de ≥ 11 CTCs por 10 ml en la extracción basal, que es la media del número de células CK20+ que detectan en esta extracción en los 132 pacientes, obtuvieron que los pacientes que presentaban ≥ 11 CTCs por 10 ml tenían una supervivencia inferior a los que presentaban menos células. Por lo tanto la detección de ≥ 11 CTCs por 10 ml resultó ser un factor pronóstico de la enfermedad, junto con el número de ganglios linfáticos afectados, sobre la supervivencia global de la población (seguimiento de 24 meses a 83 pacientes en total). Tras esto, utilizando un punto de corte de ≥ 8 CTCs por 10 ml en la extracción pre-cirugía, que es la media del número de células CK20+ que detectaron en esta extracción en los 101 pacientes en

188

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

estadios I-III, obtuvieron que los pacientes que presentaban ≥ 8 CTCs por 10 ml tenían un tiempo libre de enfermedad más corto que los que presentaban menos células. Por lo tanto, según estos investigadores, el número de CTCs CK20+ en la extracción basal, se correlaciona con el TNM y la afectación ganglionar de los pacientes. Además, utilizando el número medio de CTCs detectadas en la población como puntos de corte, la detección de CTCs antes de cirugía se correlaciona con la recurrencia, la enfermedad metastásica y la supervivencia global de la población. Según la bibliografía consultada, la detección de CTCs, o porcentaje de pacientes CK+, en cáncer colorrectal no metastásico va a depender de: el momento en el que se extraiga la muestra sanguínea, pre- o post-cirugía; y de los anticuerpos de aislamiento y detección empleados. En cuanto a la influencia que tiene el mAb de aislamiento en la detección de CTCs en sangre periférica, hay que tener en cuenta que dentro de emplear un mismo mAb, como el anti-EpCAM, el tipo de clon utilizado también influye. Antolovic y cols. (2010) demostraron que la detección de CTCs en pacientes con cáncer de colon (I-IV) dependía del clon anti-EpCAM empleado en el enriquecimiento inmunomagnético. En este

trabajo

se

utilizaron

dos

sistemas

de

enriquecimiento

inmunomagnético, que se aplicaron tras un gradiente de densidad con ficoll: el primero empleaba el clon Ber-EP4 (reconoce dos antígenos de 34 KDa y 39 KDa en EpCAM) y el segundo el clon KS1/4 (reconoce un antígeno de 40-42 KDa en EpCAM). La detección de las CTCs fue por técnicas moleculares (RT-PCR) y el marcador empleado fue la CK20. Los resultados mostraron que 11 de los 39 pacientes estudiados (28%)

189

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

presentaban CTCs (CK20+); de estos 11 pacientes con CTCs: 6 fueron detectados con el clon Ber-EP4, y 5 con el KS1/4; en ningún caso se produjo

la

detección

de

CTCs

(CK20+)

por

ambos

sistemas

simultáneamente. Por lo tanto, las diferencias encontradas entre los trabajos de Wind y cols. (2009) y Thorsteinsson y cols. (2011) vs. Wong y cols. (2009) se pueden deber a los clones anti-EpCAM empleados, y no a que utilicen diferentes mAb de detección. Pero, según la casa comercial Invitrogen (el kit de enriquecimiento inmunomagnético empleado por Wong y cols., (2009) es el CELLection Epithelial Enrich, Dynal Biotech, Dynal® de Invitrogen), el clon Ber-EP4 tiene la misma reactividad que el clon HEA125. Esto indicaría que es el mAb de detección la causa de la diferencia que existe entre los porcentajes de pacientes con CTCs que se detectan entre estos trabajos. De forma global, excepto el trabajo de Wong y cols. (2009), los estudios que analizan la extracción pre-cirugía obtienen unos porcentajes de pacientes con CTCs en sus muestras sanguíneas similares a los obtenidos en el tercer trabajo experimental de esta tesis.

1.2.2. Tamaño de la población de estudio y tiempo de seguimiento El tamaño muestral (número de pacientes de la población) y el tiempo de seguimiento de la población varía mucho entre los diferentes estudios, tanto de pacientes con cáncer de mama como de pacientes con cáncer colorrectal, según el objetivo que se quiera alcanzar: •

Cuando el objetivo del estudio es comprobar el valor pronóstico de la detección de CTCs en la extracción basal, el tamaño de la población de estudio y el tiempo de seguimiento oscilan entre: 20 pacientes

190

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

con cáncer de colon no metastásico, con un seguimiento de un mes [Thorsteinsson y cols., 2011], y 430 pacientes con cáncer colorrectal metastásico,

con

un

seguimiento

mínimo

de

11

meses

[Cohen y cols., 2009]. •

Cuando el objetivo es analizar si la detección de las CTCs sirve como marcador de respuesta al tratamiento empleado o como sistema de monitorización del mismo, el tiempo de seguimiento y el tamaño de la población de estudio oscilan entre: los 5 meses de seguimiento a 177 pacientes con cáncer de mama metastásico [Hayes y cols., 2006], y los 28 meses de seguimiento a 58 pacientes con cáncer de mama [Camara y cols., 2007].



Cuando el objetivo es estudiar las anomalías cromosómicas de las CTCs y poder compararlas con el tumor primario, el número de casos estudiados oscila entre los 31 pacientes [Fehm y cols., 2002] y los 77 [Leversha y cols., 2009], y no se hace referencia al tiempo de seguimiento. Ya que uno de los objetivos de esta tesis es el análisis del valor

pronóstico de la detección de CTCs en la sangre periférica de pacientes, con cáncer de mama y colon, antes de cirugía o de iniciar el tratamiento adyuvante y/o en primera línea, se puede decir que tanto el tamaño de las poblaciones de estudio como el tiempo de seguimiento realizado a los pacientes no son inferiores a los empleados por otras investigaciones con este mismo fin. Aún así, algunos de los resultados que se han obtenido, en los trabajos experimentales, deberían ser ratificados en poblaciones de estudio más grandes durante periodos de tiempo más extensos.

191

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

3.

Características de las técnicas empleadas

1.3.1. Anticuerpos utilizados 1.3.1.1. Anticuerpo de aislamiento de CTCs El anticuerpo monoclonal (mAb) utilizado para el aislamiento de las CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama y colon, es el mAb anti-citoqueratinas 7/8 (clon CAM5.2; isotipo: Inmunoglobulina (Ig)

G2a;

ratón

anti-humano.

Miltenyi

Biotec)

que

reconoce

específicamente las citoqueratinas (CKs) 7/8, pero no reconoce los heterodímeros de CKs 8-18 ni 8-19. Este mAb de aislamiento se ha utilizado en varios estudios, tanto para la marcación magnética específica de células tumorales mamarias [Martin y cols., 1998; Fehm y cols., 2002], como de células tumorales de colon [Molnar y cols., 2001; Weihrauch y cols., 2002; Fehm y cols., 2002]. A la hora de la elección del mAb de aislamiento celular hay que tener en cuenta la heterogeneidad propia de cada tumor, es decir, cada tipo de tumor expresa diferentes antígenos epiteliales específicos y diferentes niveles de expresión de estos antígenos. Por ejemplo, en el epitelio mamario aparecen expresadas, sobre todo, las CKs 7/8/18/19 [Moll y cols., 1982]; y éstas son también las CKs más expresadas en los tumores

de

mama,

pero

esta

expresión

puede

variar

durante la progresión tumoral [Willipinski-Stapelfeldt y cols., 2005; Woelfle y cols., 2004]. En el epitelio del colon aparecen expresadas, sobre todo, las CKs 8/18/19/20 [Moll y cols., 1982; Moll, 1991]; pero esta expresión

puede

[Polley y cols., 2006].

192

variar

durante

la

progresión

tumoral

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Hay que tener en cuenta varios hechos que afectan, sobre todo, al aislamiento de CTCs en pacientes con cáncer de colon: el primero, la expresión de CK7 se encuentra en tumores de ovario, endometrio, mama y pulmón, pero no en tumores del tracto gastrointestinal inferior [Rubin y cols., 2001; Chu y cols., 2000; Lugli y cols., 2008]; segundo, la marcación por CK7 y CK20, se emplea para diferenciar el origen de lesiones

metastásicas

de

cáncer

de

colon

y

de

pulmón

[Kummar y cols., 2002; Varadhachary y cols., 2004]; y por último, la expresión de CKs puede variar durante la progresión tumoral [Woelfle

y

cols.,

2004;

Willipinski-Stapelfeldt

y

cols.,

2005;

Polley y cols., 2006], y esta variación se puede detectar en las CTCs aisladas [Fehm y cols., 2002; Mikolajczyk y cols., 2011]. Por lo tanto, hay que ser consciente de las limitaciones del anticuerpo anti-CKs 7/8 en el aislamiento de CTCs de sangre periférica de pacientes con cáncer de mama y colon, especialmente en estos últimos. Respecto a esto hay que señalar que, cuando se realizan los ensayos de eficacia de la técnica se hacen recuentos celulares en controles positivos, los cuales se procesan mezclando sangre periférica de voluntarios sanos con 1.000 células tumorales, de las líneas tumorales MCF-7, MDA-MB-231 y SK-Br-3 (líneas celulares de cáncer de mama humanas) y las líneas tumorales HT-29 y Caco-2 (líneas celulares de cáncer de colon humanas), siguiendo el protocolo publicado en 2003 [Gaforio y cols., 2003]. Los rangos de recuperación que se obtienen son: del 60% al 80% (cálculos basados en el número total de células tumorales que se mezclan con la sangre periférica de voluntarios sanos) para las líneas celulares de cáncer de mama; y un rango un poco inferior para las líneas celulares de cáncer de colon (40%-75%, datos no mostrados). En los controles de Caco-2, los rangos de recuperación de células tumorales son

193

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

inferiores a los obtenidos para las demás líneas, además esta línea celular se marca menos (marcación anti-CKs 7/8) (resultados no mostrados), esto se puede deber a que la línea Caco-2 expresa la CK8 en menor proporción que las otras líneas [Dimmler y cols., 2001]. Ocurre algo similar con la línea tumoral MDA-MB-231, resultado que queda reflejado en el nivel de recuperación de células tumorales de esta línea en la Tabla 1 del trabajo publicado en 2008 [Campos y cols., 2008] (Capítulo 4. Resumen global de los resultados: Resultados del trabajo experimental del capítulo 1). Este último resultado fue contrastado por biología molecular, para lo que se realizó una extracción de mRNA y una retrotranscripción seguida por la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para las CKs 7/8 en las líneas tumorales MCF-7 y MDA-MB-231, y se obtuvo que la línea tumoral MDA-MB-231 presentaba una expresión más baja o casi nula de CK8 (resultados no mostrados), resultado que concuerda con el trabajo de Hollestelle y cols. (2010). De aquí se puede deducir que, debido a que no todas las líneas de células tumorales expresan las CKs 7/8 en la misma proporción [Dimmler y cols., 2001; Hollestelle y cols., 2010], para estar seguros de los porcentajes celulares de recuperación que se obtienen, con este mAb, deberíamos emplear diferentes líneas tumorales. Además, las líneas de células tumorales que se usen deben ser del mismo tipo tumoral que el tumor que se va a estudiar, y no cumplir solo el requisito de ser epiteliales.

194

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

1.3.1.2. Anticuerpo de detección de CTCs El mAb seleccionado para la detección de CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama; ocho pacientes con cáncer de colon; y para los controles de recuperación celular, es el mAb anti-CKs 7/8-FITC (clon CAM5.2; isotipo: IgG2a; ratón anti-humano. Miltenyi Biotec), seguido por el conjugado fosfatasa alcalina anti-FITC (isotipo: IgG1 de ratón. Miltenyi Biotec). Antes de aplicar esta marcación en las muestras clínicas, se comprobó en extracciones sanguíneas de 15 voluntarios sanos sin patología diagnosticada en curso, que no existía marcación por parte del mAb utilizado. El mAb escogido para la detección de las CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer de colon y para realizar los controles de la técnica de Inmunofenotipación y análisis citogenético en interfase fluorescente como herramienta para la investigación de neoplasias (Fluorescence immunophenotyping and interphase cytogenetics as a tool for investigation of neoplasm, FICTION) fue el anticuerpo biclonal AE1/AE3 (isotipo: IgG1; ratón anti-humano. BioGenex). Este anticuerpo está formado por la mezcla de dos clones que reconocen diferentes CKs. El clon AE1 detecta las CKs de alto peso molecular 10, 14, 15, y 16, y también la CK19 de bajo peso molecular; y el clon AE3 detecta las CKs de alto peso molecular 1, 2, 3, 4, 5, y 6, y las CKs 7 y 8 de bajo peso molecular. Con la combinación de estos dos clones se obtiene un cóctel de anticuerpos con un espectro de reactividad muy amplio. Tras la marcación por el anticuerpo AE1/AE3 se añaden dos mAbs secundarios de forma secuencial. El primer mAb secundario utilizado es el Alexa Fluor 350 (isotipo: IgG (H+L); conejo anti-ratón. Invitrogen), el cual

195

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

reconoce la cadena pesada de la IgG y todas las clases de cadenas ligeras de las Igs de ratón, y el segundo es el Alexa Fluor 350 (isotipo: IgG (H+L); cabra anti-conejo. Invitrogen), que reconoce la cadena pesada de la IgG y todas las clases de cadenas ligeras de las Igs de conejo, ambos mAbs van conjugados con el fluorocromo Alexa Fluor 350 (longitud de onda excitación-emisión, 346-442 nm), creando así una cascada de fluorescencia. Antes de aplicar esta marcación secuencial de varios mAbs en el segundo trabajo experimental, se realizaron varios controles con células tumorales de las líneas MCF-7 y MDA-MB-231. Estos controles se realizaron para comprobar que no existían falsos positivos por parte del anticuerpo de detección y los mAbs secundarios, y además se comparó la marcación obtenida, en ambas líneas de células tumorales, por el anticuerpo AE1/AE3 y el MNF116, por inmunofluorescencia (IF) indirecta. El resultado que se obtuvo fue que no existían uniones inespecíficas por parte de los anticuerpos empleados, ni secundarios ni primarios, y el AE1/AE3 marcaba las células tumorales de forma más intensa que el MNF116 (resultados no mostrados). Los mAbs, de aislamiento y detección, escogidos poseen una gran influencia sobre la recuperación y marcación de las CTCs en sangre periférica. En el primer trabajo experimental de esta tesis, si se comparan los resultados obtenidos con los de otros grupos de investigación, parece que la utilización del mAb anti-CKs 7/8 de aislamiento y detección no influye en el número de pacientes a los que se les detectan células CK+ en sangre periférica. Pero en el tercer trabajo experimental se puede observar una menor detección de pacientes con células CK+, si se comparan con los obtenidos por Wong y cols. (2009), que emplean

196

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

anti-EpCAM como mAb de aislamiento y anti-CK20 como mAb de detección. Dejando de lado las diferencias que se han explicado antes en el apartado Población de pacientes y tiempo de seguimiento, entre el trabajo de Wong y cols., (2009) vs. Thorsteinsson y cols., (2011) y Wind y cols., (2009), y centrándome en: la baja expresión de CK7 que existe en tumores primarios de cáncer colorrectal; y los resultados de recuperación celular obtenidos en las líneas de cáncer de colon, debo decir que existe la posibilidad de que el mAb anti-CKs 7/8, que se ha utilizado para el aislamiento de las CTCs, no sea el más adecuado y por lo tanto los resultados obtenidos se pueden deber a esta limitación del estudio.

1.3.2. Técnica de aislamiento: doble gradiente de densidad y enriquecimiento inmunomagnético La frecuencia de detección de células citoqueratina positivas (CK+) en sangre periférica de pacientes con cáncer, depende directamente del método de aislamiento de las CTCs que se emplee, y varía según los estudios realizados, tanto en cáncer de mama [Kasimir-Bauer y cols., 2001; Beitsch y Clifford, 2000] como en cáncer colorrectal [Zhang y cols., 2005; Cohen y cols., 2008], por lo tanto para poder realizar una comparación de los resultados que se obtienen, sería necesario efectuar una estandarización internacional de los protocolos que se utilizan en la detección de CTCs. En general menos de 10 células tumorales por mililitro son aisladas en la sangre periférica de pacientes con cáncer, incluso de pacientes metastásicos, por lo tanto, es imprescindible la utilización de técnicas de enriquecimiento de la muestra [Ring y cols., 2004]. Está

197

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

totalmente aceptado que el método de aislamiento de células tumorales es un paso crítico [Pantel y Otte, 2001], y que en los pasos previos a la examinación microscópica existen pérdidas celulares que se estiman de hasta un 60% [Goeminne y cols., 2000]. En los trabajos experimentales de esta tesis, se ha aplicado un sistema

de enriquecimiento de la muestra doble: primero, una

centrifugación en doble gradiente de densidad; y segundo, una selección inmunomagnética positiva. •

Con el enriquecimiento por centrifugación en doble gradiente de densidad se consigue aislar la fracción de células mononucleares o fracción mononuclear (MNC) y la fracción de células granulocíticas o fracción granulocítica (GC) de las muestras de sangre periférica, sin afectar la viabilidad celular [English y Andersen, 1974]. Tras esto, se

comprobó en

qué

fracción celular

sedimentaban

preferentemente las células tumorales mamarias, y se observó que la mayor parte de ellas sedimentan junto a la fracción MNC [Figura 2 del primer trabajo experimental (Capítulo 4. Resumen global de los resultados: Resultados del trabajo experimental del capítulo 1)], pero también eran detectadas en la fracción GC. Este mismo ensayo se repitió con 1.000 células tumorales de líneas celulares de cáncer de colon (HT-29 y Caco-2), y los resultados obtenidos fueron muy similares a los de las líneas celulares de cáncer de mama (datos no mostrados). Hay que tener en cuenta que los resultados obtenidos por este modelo experimental no pueden predecir los resultados que se obtendrán en las muestras clínicas. Se sabe que las líneas celulares tumorales de cultivos son células muy homogéneas, mientras que las CTCs varían ampliamente en tamaño, forma y peso. Es razonable, por 198

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

lo tanto, asumir que un número importante de células tumorales sedimentarán con la fracción GC en las muestras clínicas. De acuerdo con esta hipótesis, Partridge y cols. (1999) demostraron que al analizar muestras sanguíneas de pacientes con cáncer epitelial de cuello y cabeza, hallaban células tumorales que sedimentaban con la fracción GC. Los resultados del primer trabajo experimental de esta tesis sugieren que las células tumorales de líneas mamarias pueden ser perdidas si solo se evalúa la fracción MNC. Debido a que posteriormente se comprobó que ocurría algo muy similar con las líneas de colon, es lógico recomendar la examinación de ambas fracciones, tanto MNC como GC, en todos los protocolos de enriquecimiento celular para la detección de CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama y colon. •

Como segundo paso se utiliza un enriquecimiento inmunomagnético, que es una técnica sensible y específica, para obtener una suspensión celular con una mayor proporción de CTCs. Martin y cols. (1998)

estandarizaron

la

técnica

de

enriquecimiento

inmunomagnético que se ha utilizado tras la centrifugación en doble gradiente de densidad. Varios grupos de investigación han utilizado el mismo procedimiento de enriquecimiento que se ha empleado (Carcinoma Cell Enrichment kit; sistema MACS; Miltenyi Biotec), o un método similar al expuesto en esta tesis, seguido por diferentes sistemas de detección, como pueden ser técnicas de IF o citometría de flujo, demostrando obtener unos porcentajes similares de detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial a los expuestos en el primer trabajo experimental de esta tesis (62% de pacientes con cáncer de mama presentan CTCs en sangre periférica). Por ejemplo: Racila y cols. (1998) evaluaron la

199

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

sangre periférica de pacientes con cáncer de mama y detectaron células CK+ en 32 de los 33 pacientes estudiados, para su estudio emplearon una combinación de un método de enriquecimiento inmunomagnético y citometría de flujo; Engel y cols. (1999) analizaron muestras de sangre periférica de pacientes con cáncer de mama y de ovario, y detectaron células CK+ en 35 de los 48 pacientes (72,9%) empleando un método que combinaba una selección inmunomagnética (MACS) seguida por FISH; Martin y cols. (1998) examinaron muestras de sangre periférica de pacientes con carcinoma de mama, próstata, colon, recto y pulmón, y detectaron células CK+ en 21 de los 34 pacientes examinados (61,8%), utilizando el método MACS seguido por una detección inmunocitoquímica (ICC); Cristofanilli y cols. (2004), empleando una combinación de un método de enriquecimiento de ferrofluidos e IF para la detección de CTCs en sangre periférica, detectaron ≥ 5 células CK+ en 87 de los 177 pacientes con cáncer de mama que estudiaron (49%); Dawood y cols. (2008) detectaron células CK+ en 114 de las 185 muestras sanguíneas de pacientes con cáncer de mama que analizaron (61,6%) empleando el mismo sistema que Cristofanilli y cols. (2004). En cuanto a los porcentajes de detección de pacientes con cáncer de colon que presentan células CK+ (9,09%), esto ha sido comentado en el apartado Características del estudio: Población de pacientes y tiempo de seguimiento de la Discusión. El enriquecimiento inmunomagnético mejora la detección de células CK+ en las muestras. El estudio de Königsberg y cols. (2010) analiza la recuperación celular, de una línea de cáncer de colon mezclada con sangre periférica de voluntarios sanos, al aplicar diferentes sistemas de enriquecimiento, y obtiene una mayor recuperación al aplicar un

200

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

enriquecimiento inmunomagnético que un enriquecimiento basado en las características físicas de las células tumorales. Los mismos resultados aparecen al comparar los porcentajes de pacientes CK+ detectados en estudios que emplean un enriquecimiento inmunomagnético, con los obtenidos por trabajos que solo emplean un método de enriquecimiento basado en las características físicas de las células tumorales: Weihrauch y cols. (2002), obtuvieron que un 65% de los pacientes con cáncer de colon presentaban células CK+ en médula ósea, tras un enriquecimiento inmunomagnético de la muestra vs. Leinung y cols. (2000), que obtuvieron un 24,8% de pacientes con cáncer de colon con células CK+ tras un enriquecimiento por gradiente de densidad; Woelfle y cols. (2005), obtuvieron que un 35% de los pacientes con cáncer presentaban células

CK+

en

médula

ósea,

empleando

un

enriquecimiento

inmunomagnético, vs. 21% sin este método de enriquecimiento inmunomagnético. La limitación más significativa de este método es la carencia de un marcador tumoral específico para las células tumorales que se encuentran en sangre periférica. Como marcadores más utilizados en el enriquecimiento

de

la

muestra

están

la

EpCAM

y

las

CKs

(sobre todo CKs 7/8). Algunos investigadores han recomendado que el enriquecimiento inmunomagnético por selección positiva de células tumorales debe optimizarse usando un combinado de marcadores. Por ejemplo, con la combinación de CKs y EpCAM se obtienen porcentajes de detección de CTCs superiores a cuando se emplea uno de estos marcadores

de

forma

individual

[Deng

y

cols.,

2008;

Mikolajczyk y cols., 2011].

201

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

La EpCAM es una molécula de superficie que está expresada en la mayor parte de células epiteliales y carcinomas [Spizzo y cols., 2002; Went y cols., 2006; Went y cols., 2008]. Por lo tanto, se considera un marcador de células tumorales epiteliales localizadas en tejidos hematopoyéticos,

como

médula

ósea

y

sangre

periférica

[Meng y cols., 2004a; Cristofanilli y cols., 2004; Cohen y cols., 2008; Sastre y cols., 2008]. El principal problema de utilizar la EpCAM para el aislamiento de CTCs es que se produzcan falsos negativos debido a que no se detectan las CTCs que no la expresan [Antolovic y cols., 2010; Mikolajczyk y cols., 2011], ya que no todos los tumores expresan esta molécula y hay tejidos que tienen una regulación muy baja de las moléculas de adhesión durante la progresión tumoral [Tai y cols., 2007; Willipinski-Stapelfeldt y cols., 2005; Paterlini-Brechot y Benali, 2007; van der Gun y cols., 2008]. También pueden ocurrir falsos positivos debido a la detección de células no tumorales que expresan EpCAM [Choesmel y cols., 2004a]. Las CKs son parte del citoesqueleto de las células epiteliales, exactamente forman los filamentos intermedios de éstas, y son características de estas células, por lo tanto, al igual que la EpCAM, se consideran un marcador de células tumorales epiteliales localizadas en tejidos hematopoyéticos. Sin embargo, se han descrito expresiones de CKs en: procesos inflamatorios [Kowalewska y cols., 2010]; y por parte de las MNC [Kaho y Huan, 2002; Kowalewska y cols., 2010], sobre todo, en muestras de aspirados de médula ósea [Choesmel y cols., 2004b], que pueden contribuir a la detección de falsos positivos, principalmente en ensayos que utilizan técnicas moleculares para la detección de CTCs. Aunque las CKs se expresan en todos los tumores sólidos de origen epitelial [Moll y cols., 1982; Moll, 1991], hay que tener en cuenta que

202

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

pueden

modificar

su

expresión

durante

la

progresión

tumoral [Woelfle y cols., 2004; Willipinski-Stapelfeldt y cols., 2005; Polley y cols., 2006; Paterlini-Brechot y Benali, 2007], por lo que en sangre periférica pueden aparecer CTCs con baja expresión de CKs e incluso negativas para este marcador (CTCs que expresan CK pero por debajo del nivel de detección que se está utilizando o diferentes CKs a las empleadas) [Fehm y cols., 2002; Mikolajczyk y cols., 2011]. Si bien las CKs han sido validadas como un marcador de células tumorales de origen epitelial en sangre, tanto para el cáncer de mama como para el cáncer colorrectal [Molnar y cols., 2001; Fehm y cols., 2002; Gaforio y cols., 2003; Cristofanilli y cols., 2004; Cohen y cols., 2008; Wong y cols., 2009], hay que recordar que no son marcadores tumorales específicos.

1.3.3. Técnicas de detección de CTCs La limitación más importante que presentan las técnicas de detección, al igual que la técnica de enriquecimiento inmunomagnético, es la carencia de un marcador tumoral específico de CTCs. El marcador más utilizado son las CKs, aunque hay que tener en cuenta lo que se ha comentado anteriormente. Cuando la detección se realiza por técnicas inmunológicas, ICC e IF, tras el enriquecimiento de la muestra se realiza la marcación de las células tumorales con mAbs frente a antígenos específicos, como pueden ser: CK20 y mucinas, en cáncer gastrointestinal y de vejiga [Soeth y cols., 1997; Retz y cols., 2001; Hardingham y cols., 2000]; el antígeno específico de próstata (PSA) en cáncer de próstata [Ghossein

y

cols.,

1997];

la

tiroquinasa

en

melanoma

[Ghossein y Bhattacharya, 2000; Schittek y cols., 2001]; y mamaglobulina,

203

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

CKs, mucinas (MUC1) y la proteína HER2 en cáncer de mama [Zach y cols., 2000; Zach y cols., 2002; Naume y cols., 2001; Grunewald y cols., 2000; de Cremoux y cols., 2000; Benoy y cols., 2004; Swerts y cols., 2004; Slade y cols., 2005; Wülfing y cols., 2006; Munzone y cols., 2010; Ignatiadis y cols., 2011]. Las CKs que más se utilizan en la detección de CTCs, por técnicas ICC y de IF, en cáncer de mama son las CKs 7/8/18/19 [Gaforio y cols., 2003; Cristofanilli y cols., 2004; Cristofanilli y cols., 2005], y en cáncer colorrectal son las CKs 8; 18; 19; y 20 [Cohen y cols., 2008; Maestro y cols., 2009; Cohen y cols., 2009; Wong y cols., 2009], aunque también se utilizan anticuerpos denominados pan-antiCKs que incluyen un rango más amplio de detección de éstas. Cómo el mAb MNF116, que reconoce las CKs 5, 6, 8, 17 y 19 [Molnar y cols., 2001]; o el mAb C11 que reconoce las CKs 4-6, 8, 10, 13 y 18 [Fehm y cols., 2002]; o el cóctel de anticuerpos AE1-AE3, que reconoce las CKs 1-8, 10, 14-16, y 19 [Campos y cols., 2008]. La elección de estos marcadores va a depender del tipo de tumor estudiado, y hay que recordar que la mayoría de ellos no son específicos de células tumorales. Las técnicas empleadas como sistema de detección de CTCs en esta tesis han sido la ICC y la IF indirecta. Ambas son técnicas muy específicas, ya que utilizan mAbs para el reconocimiento de los marcadores deseados (mAb dirigidos frente a proteínas o a epítopos muy específicos), pero en ambos casos se pueden originar falsos positivos en la detección de CTCs. Esto se puede deber a que exista una expresión mínima o ilegítima del marcador estudiado en la población de células que no nos interesa, por ejemplo: anti-mucinas [Brugger y cols., 1999] y anti-CKs [Vagunda y cols., 2001]. Además, cuando se emplean técnicas

204

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

inmunológicas, hay que tener en cuenta que pueden aparecer falsos negativos debidos a que las células metastásicas tumorales in vivo pueden no expresar los marcadores que se han estudiado in vitro (líneas celulares) o si lo hacen, que lo hagan en niveles muy bajos, debido a la heterogeneidad del tumor [Zehentner, 2002; Fehm y cols., 2002; Mikolajczyk y cols., 2011]. En el caso de la técnica ICC, también pueden aparecer falsos positivos debidos a los sistemas de revelado empleados, fosfatasa alcalina o peroxidasa [Braun y Pantel, 1999]. El sistema de revelado empleado, en el primer trabajo experimental y en los controles de recuperación celular, ha sido la fosfatasa alcalina y el sustrato de la enzima para obtener el precipitado de color rojo (Fast Red TR/Naphthol AS-MX solución sustrato, Sigma-Aldrich). Aunque se ha empleado, para el enriquecimiento inmunomagnético y la detección por ICC, un método estandarizado previamente [Martin y cols., 1988], se realizaron controles al inicio del estudio para asegurar que no existían falsos positivos. Otra limitación que presenta la técnica de ICC es que el sustrato de la enzima se revela colorimétricamente, por lo tanto a la hora de evaluar varios marcadores simultáneamente en las células tumorales aisladas hay que acoplar varios sistemas de revelado, utilizando diferentes enzimas y sustratos, haciendo que la metodología se vuelva complicada.

205

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Para asegurar la alta especificidad de los ensayos, se incorporaron los siguientes controles y precauciones en los estudios: i.

Los controles positivos (células de líneas tumorales que se mezclan con sangre periférica de voluntarios sanos) son procesados de forma separada a las muestras de los pacientes, para evitar contaminación;

ii.

Los primeros mililitros de sangre que se colectan del paciente son desechados para evitar contaminación por células epiteliales;

iii.

En el primer trabajo experimental se emplea un método de enriquecimiento inmunomagnético seguido de una detección inmunocitoquímica, los cuales han sido estandarizados previamente [Martin y cols., 1998];

iv.

Antes de la marcación con el anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CKs, se emplea un reactivo de bloqueo de los receptores Fc de las células (leucocitarias) que impide la formación de uniones inespecíficas;

v.

El mAb CAM5.2 (anti-CKs 7/8) es el que se utiliza para la marcación magnética específica de células tumorales mamarias. Distintos e independientes estudios han evaluado el uso de varios mAbs para la detección de células tumorales diseminadas y han demostrado que el mAb CAM5.2 origina una marcación fuerte y uniforme en carcinomas primarios derivados de varios órganos, incluido de mama [Martin y cols., 1998]. Este mAb también ha sido empleado para la marcación magnética de células tumorales de colon [Molnar y cols., 2001; Weihrauch y cols., 2002; Fehm y cols., 2002]. Para evitar falsos positivos en la evaluación de las muestras, solo

se han considerado células CK+ las que presentaban las siguientes características: células nucleadas con morfología de célula tumoral, mayor ratio núcleo/citoplasma, y una marcación fuerte para las CKs.

206

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

La especificidad de los ensayos fue confirmada empleando controles de voluntarios sanos (controles negativos), donde no se detectó células CK+. Una vez establecida la validez de la técnica en la detección de CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama, se realizó una modificación que permitía evaluar simultáneamente el fenotipo y el genotipo de las CTCs aisladas, examinando simultáneamente el número de copias de ERBB2/TOP2A/CEP17 y la expresión de las CKs 1-8/10/1416/19 en estas células por IF indirecta. Esto se realizó aplicando la técnica FICTION tras el enriquecimiento inmunomagnético. La técnica FICTION fue desarrollada para poder asignar a células tumorales un clon citogenéticamente definido y, al mismo tiempo, poder determinar su linaje celular [Weber-Matthiesen y cols., 1992; Weber-Matthiesen y cols., 1993]. Esta técnica ha demostrado ser útil en el estudio de neoplasias hematógenas [Nylund y cols., 1993; Haferlach y cols., 1997; Temple y cols., 2004; Young y cols., 2006] y algunos tumores sólidos [Terada y cols., 2000; Zhang y cols., 2000; Dettori y cols., 2003]. En el caso de tumores sólidos, Zhang y cols. (2000) emplearon esta técnica en seis líneas celulares de cáncer de mama para conocer la relación que existía entre la expresión del receptor de estrógenos (ER) y la deleción del gen del receptor de estrógenos (ESR). Terada y cols. (2000) estudiaron, empleando la técnica FICTION, en 105 pacientes con cáncer gástrico la frecuencia de células positivas para el antígeno nuclear de proliferación celular y las aberraciones en el cromosoma 17 de estas células, demostrando que eran indicadores del potencial metastásico del tumor. Dettori y cols. (2003) emplearon esta técnica para evaluar la expresión del antígeno de membrana mitocondrial

207

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

y estudiar simultáneamente las aberraciones en el cromosoma 18 que presentaban pacientes con tumores tiroideos. En el segundo y tercer trabajo experimental de esta tesis, se empleó como sistema de detección de CTCs la IF indirecta. Esta técnica es muy similar a la ICC empleada anteriormente, sin embargo el mAb usado en la detección no va unido a un sistema de revelado enzimático sino a un sistema de revelado por fluorescencia. En los ensayos realizados en esta tesis, se utilizó, una cascada de dos mAbs secundarios fluorescentes, de forma que se amplifica la señal de fluorescencia y se pueden reconocer más fácilmente las CTCs. Los resultados obtenidos en los controles positivos, sangre periférica de voluntarios sanos mezclada con células tumorales de líneas mamarias y de colon, muestran que las células tumorales presentan una marcación fluorescente azul [Figura 1 del segundo trabajo experimental (Capítulo 4. Resumen global de los resultados: Resultados del trabajo experimental del capítulo 2) y figura 1 del tercer trabajo experimental (Capítulo 4. Resumen global de los resultados: Resultados del trabajo experimental del capítulo 3)] y una preservación buena de su morfología. La especificidad de los ensayos fue confirmada empleando controles de voluntarios sanos (controles negativos); donde no se detectó, en ninguno de ellos, células CK+ (con fluorescencia azul). Para asegurar la alta especificidad de los ensayos, se incorporan a las precauciones anteriormente descritas las siguientes: i. Uso del anticuerpo biclonal AE1/AE3 (pan-antiCKs) para el inmunofenotipaje; ii. Utilización de un suero bloqueante (suero de conejo), de la misma especie animal en la que se desarrolla el primer mAb secundario

208

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

fluorescente (conejo anti-ratón), para evitar uniones inespecíficas del primer mAb secundario y por lo tanto amplificar una señal errónea. La IF a diferencia de la ICC no tiene limitación a la hora de evaluar dos marcadores o más simultáneamente. Los mAbs que se utilizan en esta técnica pueden ir conjugados, directa o indirectamente, con diferentes fluorocromos. Los fluorocromos son moléculas que emiten fluorescencia al absorber energía de una longitud de onda específica, la fluorescencia emitida es fácil de detectar a través de un sistema de filtros y de detección de la misma, por ejemplo: por citometría de flujo o microscopia de fluorescencia. Existe una amplia gama de fluorocromos (que dan lugar a una amplia gama de fluorescencias (colores), dependiendo de la longitud de onda emitida por cada uno), que se pueden emplear para estudiar

simultáneamente

varios

marcadores

en

las

CTCs

[de Bono y cols., 2007; Stojadinovic y cols., 2007b; Cao y cols., 2010]. El único límite que existe en esta técnica es que se deben utilizar mAbs conjugados con fluorocromos, o con sistemas de revelado de amplificación de la señal, que no se solapen en su rango de longitudes de onda de absorción y emisión. En ambos tipos de técnicas de detección, ICC e IF indirecta, se puede producir una pérdida de especificidad en el ensayo debida a la pequeña proporción de CTCs que existen en la muestra, comparadas con la cantidad de células hematopoyéticas presentes. Así que, tanto la técnica escogida como el marcador utilizado para la detección son cruciales para obtener la mayor sensibilidad y especificidad posible [Ko y cols., 2000; Silva y cols., 2001].

209

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

En cuanto a la evaluación genética realizada en los trabajos experimentales, los resultados obtenidos demuestran que la técnica FICTION puede ser empleada para evaluar la amplificación o deleción de genes en líneas celulares [Figura 2 del segundo trabajo experimental (Capítulo 4. Resumen global de los resultados: Resultados del trabajo experimental del capítulo 2) y figura 1 del tercer trabajo experimental (Capítulo 4. Resumen global de los resultados: Resultados del trabajo experimental del capítulo 3)] o en CTCs de sangre periférica de pacientes con tumores sólidos de origen epitelial [Figura 2 del tercer trabajo experimental (Capítulo 4. Resumen global de los resultados: Resultados del trabajo experimental del capítulo 3)], sin ningún problema. Los resultados obtenidos en las líneas celulares de cáncer de mama, coinciden con las evaluaciones genéticas llevadas a cabo por otros grupos de investigación que emplean otras técnicas. Por ejemplo, varios trabajos han demostrado la amplificación de los genes ERBB2 y TOP2A en las células SK-Br-3 mediante técnicas como: la hibridación fluorescente in situ (FISH) [Szöllösi y cols., 1995; Järvinen y cols., 1999; Järvinen y cols., 2000; Forozan y cols., 2000]; la hibridación genómica comparativa (CGH) [Forozan y cols., 2000; Lottner y cols., 2005]; y el cariotipado espectral [Kytölä y cols., 2000]. Otros trabajos han demostrado la deleción del gen ERBB2 en MCF-7 por técnicas como FISH [Szöllösi y cols., 1995] y CGH [Shadeo y Lam, 2006]; y un número de copias normal de este gen en MDA-MB-231 por cariotipado de bandas-G [Satya-Prakash y cols., 1981] y FISH [Grushko y cols., 2002; Lottner y cols., 2005]. En cuanto al gen TOP2A, no he encontrado estudios que indiquen su estado en estas dos líneas tumorales.

210

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

La técnica FICTION permite, además, poder realizar una segunda marcación de moléculas de superficie en las CTCs aisladas, y analizadas previamente. Se puede de esta forma, analizar la expresión de una proteína en estas células tumorales tras conocer su fenotipo y genotipo. En el tercer trabajo experimental de esta tesis, se ha demostrado que se puede analizar la expresión de la proteína HER2 en las CTCs aisladas de sangre periférica, las cuales previamente habían sido caracterizadas para la expresión de CKs y el número de copias de ERBB2/CEP17. Este análisis se ha realizado en varios controles positivos y en la muestra clínica del paciente con número de identificación (IN) 28. Previo al análisis de la muestra clínica del paciente IN28, se realizaron; varios controles positivos, muestras de sangre periférica de voluntarios sanos mezcladas con células de diferentes líneas tumorales (HT-29, Caco-2, MCF-7, MDA-MB-231 o SK-Br-3) que se procesaron según el protocolo de FICTION seguido de una marcación de la proteína HER2 (protocolo de la casa comercial, DAKO, CA); y un control negativo, que se realiza igual que los controles anteriores pero se le añade peróxido de hidrógeno, para este control se empleó la línea tumoral mamaria SK-Br-3, ya que sobreexpresa esta proteína. Los resultados obtenidos en los controles demostraron que: no existían reacciones cruzadas entre el protocolo de FICTION y el de marcación de la proteína HER2 (en el control de peróxido de hidrógeno se obtiene un resultado negativo para la marcación de la proteína, que era lo que se esperaba); la morfología de las células tumorales se mantenían; y era fácilmente distinguible, a la vez que cuantificable, la marcación de la proteína HER2 en las células tumorales. Cuando se aplicó este protocolo a la muestra del paciente IN28 se pudo, además de cuantificar la expresión de la proteína HER2 en las CK+/CTCs, identificar 9 células tumorales que no habían sido

211

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

reconocidas como CK+ (CK-/CTCs), seguramente por no expresar las CKs estudiadas. Los resultados obtenidos fueron que, al igual que en los controles positivos, las CTCs de sangre periférica del paciente IN28 mantuvieron su morfología y fueron fácilmente evaluables para la expresión de la proteína HER2. En este caso, debido a que más del 10% de las CTCs analizadas sobreexpresaban la proteína, la muestra se consideró positiva para la expresión de HER2 en las CTCs. En cuanto a esto, hay que indicar que varios estudios señalan que con la evaluación de solamente 10 CTCs se puede conocer el estado de HER2 en la mayoría de los pacientes [Meng y cols., 2004a; Meng y cols., 2006; Cao y cols., 2010]. Hay que añadir que tras la puesta a punto de la metodología desarrollada en el segundo trabajo experimental, se comprobó que era posible su utilización en una muestra clínica de una paciente con cáncer de mama metastásico, antes de ser utilizada en la población de pacientes con cáncer de colon. La muestra clínica fue una extracción de sangre periférica, tomada previamente al tratamiento que se le iba a administrar a la paciente, la cual se analizó para la detección de CTCs siguiendo el protocolo publicado en 2008 [Campos y cols., 2008]. En esta muestra se pudieron detectar dos CTCs, que fueron claramente identificadas (expresión de CKs, fluorescencia azul) y cuya morfología era acorde a un fenotipo maligno. La evaluación genética mostró que ambas células tumorales eran diploides y no presentaban ninguna alteración en el número de copias de los genes ERBB2 y TOP2A (datos no mostrados).

212

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

4.

Conservación de las muestras Las muestras clínicas evaluadas por ICC, fueron procesadas hasta

el final, es decir, hasta la evaluación de las mismas. Tras esto se almacenaron en el medio en que se montaron, gelatina glicerinada (MERCK; Darmstadt, Alemania), a temperatura ambiente, junto con los controles positivos y negativos que se incluyeron en el estudio. Siguiendo este sistema se han almacenado: la primera extracción sanguínea o basal (extracción previa a la cirugía y/o al tratamiento quimioterápico, hormonoterápico y/o dirigido) de los 92 casos que se recogieron en el primer

trabajo

experimental

de

esta

tesis;

las

extracciones

correspondientes al seguimiento del tratamiento que se les estaba aplicando a estos 92 pacientes, con un intervalo de ≤ 5, 5-12, 12-24 y ≥ 24 meses; las extracciones correspondientes a las revisiones tras el tratamiento; las muestras de 20 pacientes neoadyuvantes nuevos, que se procesaron entre 2003-2004 (extracción basal y al mes del tratamiento); y la extracción basal de los primeros 8 pacientes con cáncer de colon. En total existen almacenadas de esta forma 506 muestras biológicas. En marzo de 2006, se realizó un estudio retrospectivo de 15 muestras de pacientes neoadyuvantes con cáncer de mama, en el cual se aplicó la técnica FISH para la evaluación de ERBB2/TOP2A/CEP17 en las CTCs que habían sido aisladas. Inicialmente este protocolo se ensayó en controles positivos, procesados como los controles de recuperación celular, en los que se obtuvo, de forma general: la marcación de los centrómeros en algunas células tumorales, pero nunca de los genes; una marcación génica incompleta, ya que no todos los controles positivos mostraron la hibridación de la sonda, las células hematopoyéticas de estos controles tampoco presentaban hibridación de la sonda; y la

213

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

colocalización de las células tumorales fue difícil tras la destrucción de la membrana celular. Al aplicar este protocolo en las muestras clínicas de los pacientes, se obtuvo que: el número de muestras que no hibridaron era superior al obtenido en los controles positivos; y la colocalización de las CTCs fue más difícil al aparecer un número menor de células tumorales que en los controles positivos. Por lo tanto, este tipo de procesamiento solo permite realizar un estudio de la aneusomía cromosómica de las muestras, y no de todas ellas, preferiblemente de las muestras más recientes, aunque esta premisa no asegure que la técnica FISH se pueda realizar con éxito. Las muestras clínicas procesadas para una detección por IF indirecta, pacientes con cáncer de colon, fueron procesadas hasta el aislamiento

de

las

células

tumorales

(tras

el

enriquecimiento

inmunomagnético) y almacenadas a -20 °C, junto con controles positivos y negativos que garantizarían el estado de conservación de las muestras clínicas. Inicialmente, antes de aplicar este tipo de almacenaje a las muestras clínicas y a los controles correspondientes, se realizaron varias pruebas de almacenaje a -20 ºC de varios controles positivos, durante 3 y 6 meses, y se comprobó que existía una conservación adecuada de las muestras. Además, durante el procesamiento de las muestras clínicas se fueron rescatando controles positivos almacenados a -20 ºC, que habían sido almacenados durante diferentes momentos (12 meses, 24 meses y 36 meses antes del procesamiento de las muestras clínicas y los controles correspondientes) comprobando que las muestras se conservaban adecuadamente.

214

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Una vez que se obtenía un número de muestras adecuado, tanto clínicas como de controles, se procedía con la técnica FICTION y la evaluación de las mismas. Tras esto, las muestras se almacenan a -20 °C para asegurar que la fluorescencia se mantenga el mayor tiempo posible. De esta forma han sido procesadas las muestras sanguíneas de: una paciente con cáncer de mama, de la que se obtuvo la extracción basal; 78 pacientes con cáncer de colon, de los cuales se ha obtenido la extracción basal, y 23 muestras de segunda extracción (extracción sanguínea que se realiza un mes tras el tratamiento administrado). En total existen almacenadas a -20 ºC, 102 muestras clínicas procesadas completamente. Del total de los pacientes con cáncer de colon, se obtuvieron los datos clínicos y anatomopatológicos de los primeros 33 casos, que son los que se exponen en el tercer trabajo experimental de esta tesis.

215

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

II. UTILIDAD

CLÍNICA DE LA DETECCIÓN DE

CTCS

EN SANGRE

PERIFÉRICA DE PACIENTES CON CÁNCER DE MAMA

1.

Trabajos existentes sobre el tema La presencia de células cancerosas en sangre periférica es

conocida desde antaño [Ashworth, 1869; Engell, 1955]. En los últimos años se han utilizado diferentes técnicas inmunológicas y moleculares para detectar células tumorales en médula ósea, nódulos linfáticos y sangre periférica de pacientes con cáncer [Pelkey y cols., 1996; Pantel y cols., 2003; Ross y Slodkowska, 2009; Königsberg y cols., 2010; Negin

y

Cohen,

2010;

Ignatiadis

y

Reinholz,

2011;

Königsberg y cols., 2011]. Actualmente está aceptado el valor pronóstico que tiene la detección de células tumorales diseminadas (DTCs) en médula ósea de pacientes con cáncer de mama, sobre el tiempo libre de enfermedad y la supervivencia global [Braun y cols., 2000; Braun y cols., 2001a; Solomayer y cols., 2001; Pantel y cols., 2003]. En cuanto al análisis genético de las DTCs en médula ósea, la primera evidencia de la naturaleza maligna de estas células fue expuesta en el trabajo de Müller y cols. (1996). En este trabajo se describió que las células CK+ aisladas en médula ósea de pacientes con cáncer de mama presentaban, predominantemente, un patrón diploide para el cromosoma 17 y el gen ERBB2, aunque 2 de los 9 pacientes estudiados presentaron amplificación del gen. En cuanto al análisis genético de las DTCs hay que destacar el trabajo de Schmidt-Kittler y cols. (2003), donde se propone la teoría de la evolución paralela del cáncer debido a que las DTCs de pacientes en estadio M0, además de portar menos aberraciones genéticas, portan

216

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

aberraciones genéticas diferentes a las DTCs de pacientes en estadio M1 y a las células del tumor primario, esto hace suponer que la diseminación tumoral, además de ocurrir de una forma temprana, no sucede a partir del clon más avanzado del tumor primario (modelo de “expansión y selección clonal”, entendiendo como clon más avanzado aquel que es seleccionado por presentar mutaciones más inestables que otorgan ventajas de crecimiento, que serán las responsables de la progresión tumoral y la formación de las metástasis). El problema principal que presenta este tipo de análisis es que la muestra de estudio es un aspirado de médula ósea, generalmente de cresta ilíaca o de las costillas, el cual es un proceso invasivo y resulta incómodo para el paciente, por lo tanto es difícil que se utilice como método rutinario en el seguimiento de la enfermedad. Hasta la fecha de la primera publicación incluida en esta tesis, hay que señalar que aunque existían trabajos que estudiaban la detección de CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama, la mayor parte de estos eran estudios basados en técnicas moleculares [Aerts y cols., 2001; Bischoff y cols., 2003; Stathopoulou y cols., 2003], y ninguno demostraba el valor pronóstico de la detección de estas células en sangre periférica. En cuanto a los trabajos que empleaban técnicas inmunológicas, pasaba algo parecido: dos trabajos señalaban la detección de

CTCs

como

marcador

de

monitorización

del

tratamiento

[Racila y cols., 1998; Kasimir-Bauer y cols., 2002]; los otros trabajos, o solo publicaban el método desarrollado [Martin y cols., 1998], o no demostraban el valor pronóstico de la detección de estas células [Witzig y cols., 2002], o se centraban en el análisis genético de las mismas Engel y cols., 1999; Fehm y cols., 2002]. En cuanto al estudio genético de

217

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

las CTCs, los trabajos publicados demuestran que estas células son heterogéneas respecto a las anormalidades cromosómicas que presentan, y es más frecuente la ganancia de cromosomas que la pérdida de los mismos [Engel y cols., 1999; Fehm y cols., 2002]. El trabajo de Engel y cols. (1999), señala que las anormalidades cromosómicas que presentan los tumores primarios aparecen en las CTCs, aunque en una menor frecuencia, y sus resultados sugieren que el cromosoma 17 está envuelto en la formación de micrometástasis en pacientes con cáncer de ovario y mama, de forma más frecuente que los cromosomas 7 y 12. La ventaja fundamental que presenta la evaluación de la detección de las CTCs en sangre periférica, que algunos autores han definido

como

“biopsia

líquida”

[Bednarz-Knoll

y

cols.,

2011;

Pachmann y cols., 2011; Kuhn y Bethel, 2012], es que con una mera extracción sanguínea, proceso poco invasivo y que se puede realizar de forma rutinaria, se podría realizar el seguimiento de la evolución del paciente.

2.

Relación de la presencia de CTCs en sangre

periférica de pacientes con cáncer de mama con los factores pronósticos clásicos En el primer trabajo experimental de esta tesis, se detectaron CTCs (células CK+) en el 62% de las muestras sanguíneas de los pacientes con cáncer de mama, siempre recogiendo ambas fracciones celulares, MNC y GC. Como se ha comentado antes, varios estudios obtienen porcentajes de pacientes con células CK+ en sangre periférica similares o más altos que los detectados en el primer trabajo experimental.

218

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Los resultados obtenidos en pacientes con cáncer de mama muestran que la detección de células CK+ no se produce sólo en los pacientes con cáncer avanzado (13/17 casos (76,5%) con tumores T4) sino también en 9 de los 18 casos (50%) de los pacientes con tumores pequeños (T1) [Tabla I del primer trabajo experimental (Capítulo 4. Resumen global de los resultados: Resultados del trabajo experimental del capítulo 1)]. Además, los resultados sugieren que existe una asociación entre la presencia de células CK+ en sangre periférica y el estadio de los nódulos linfáticos (p=0,033) [Tabla I del primer trabajo experimental (Capítulo 4. Resumen global de los resultados: Resultados del trabajo experimental del capítulo 1)]. No obstante, se han detectado células CK+ en sangre periférica en 5 de los 15 pacientes nódulos negativos (N0) (33,3%). Este hallazgo sugiere que, por este método, se puede identificar una diseminación temprana de células tumorales al torrente sanguíneo, y que la presencia de células tumorales en sangre periférica puede ser un evento más frecuente de lo esperado. Estos resultados concuerdan con los presentados por Solakoglu y cols. (2002) que encontraron células CK+ en médula ósea en el 78,9% de los pacientes sin metástasis (M0). Por otro lado, no se encontró ninguna correlación, estadísticamente significativa, entre la presencia de células CK+ en sangre periférica y biomarcadores como cerB-2, p53 o ki67 [Tabla I del primer trabajo experimental (Capítulo 4. Resumen global de los resultados: Resultados del trabajo experimental del capítulo 1)]. Estudios posteriores al primer trabajo experimental de esta tesis han obtenido resultados muy similares a estos, donde pacientes con tumores pequeños presentan CTCs en sangre [Fhem y cols., 2009; Lang y cols., 2009; Krishnamurthy y cols., 2010; Banys y cols., 2012]. Sin embargo, aparece disparidad en los resultados de estos estudios en

219

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

cuanto a la asociación que existe entre la presencia de CTCs y el estado de los nódulos linfáticos, por un lado hay estudios que demuestran una correlación entre ambos, aunque obtengan que pacientes N0 también presentan CTCs [Fhem y cols., 2009; Banys y cols., 2012], y por otro lado, hay

estudios

que

indican

que

no

existe

dicha

correlación

[Lang y cols., 2009; Krishnamurthy y cols., 2010]. De

forma llamativa,

los

resultados

del primer trabajo

experimental muestran una asociación significativa (p=0,049) entre la presencia de células CK+ en sangre periférica y el estatus del ER en el tumor primario, cuando se analizan los datos de todos los pacientes (metastásicos y no metastásicos). Este resultado sugiere que la expresión del ER puede conferir propiedades ventajosas a las células tumorales de mama, como la de facilitar la entrada de la célula tumoral al torrente sanguíneo o la de prevenir la apoptosis celular. En este contexto, el estudio de Lippert y cols. (2003) muestra que muchos, pero no todos, de los metabolitos endógenos del estradiol provocan un patrón bifásico en la proliferación de líneas celulares de cáncer de mama ER+, por ejemplo: a bajas concentraciones se obtiene un efecto estimulador y a altas concentraciones se obtiene un efecto inhibitorio sobre el crecimiento celular. Además se ha demostrado que los estrógenos pueden prevenir la apoptosis

a

través

de

un

mecanismo

mediado

por

los

ER

[Song y Santen, 2003]. En pacientes con cáncer de mama, las decisiones terapéuticas se realizan utilizando indicadores de predicción y pronóstico, donde el estado del ER es importante a la hora de la toma de decisión del tratamiento. Existe un consenso general en cuanto a que pacientes con cáncer de mama con tumores ER+ poseen una supervivencia más larga

220

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

que pacientes con tumores ER-, pero esto se limita a un subgrupo de pacientes específicos [Kenny y cols., 1999; Utsumi y cols., 2000; Costa y cols., 2002]. Watts y cols. (1995) sugieren que la sobreexpresión de la ciclina D1 en tumores ER+ puede conllevar insensibilidad a los antiestrógenos. Costa y cols. (2002) presentaron resultados que indicaban que el estado del receptor de progesterona en el tumor primario de pacientes con cáncer de mama es comparable al valor predictivo que tiene el estado de los ER sobre la prognosis de la enfermedad. También es importante señalar, que varios estudios recientes han demostrado que aparece una variación del fenotipo de las CTCs con respecto a los marcadores del tumor primario (HER2, ER y PgR) [Meng y cols., 2004a; Meng y cols., 2006; Fehm y cols., 2009; Fhem y cols., 2010; Somlo y cols., 2011; Banys y cols., 2012], lo cual podría explicar la resistencia que presentan algunos pacientes sometidos a ciertos tratamientos, como tratamientos hormonales o trastuzumab. Por lo tanto, es imperativo encontrar e identificar nuevos marcadores predictivos y de pronóstico de la enfermedad que puedan soportar la toma de decisiones sobre el tratamiento. Los resultados obtenidos en el primer trabajo experimental sugieren que, debido al potencial

tumorigénico

y

metastásico

que

tienen

las

CTCs

[Pretlow y cols., 2000; Fehm y cols., 2002], la detección de células CK+ en sangre periférica sería un buen indicador de una diseminación temprana de la enfermedad, y puede llevarnos a identificar un subgrupo de pacientes con cáncer de mama (que incluyen pacientes con tumor primario ER+) con un peor pronóstico.

221

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Estudios posteriores al primer trabajo experimental de esta tesis, sugieren que la diseminación de CTCs es más frecuente en pacientes con cáncer de mama cuyo tumor primario es triple negativo (HER2-/ER-/PgR-) [Fehm y cols., 2009; Banys y cols., 2012]; seguida por la diseminación de CTCs en pacientes cuyo tumor primario es del subtipo tumoral HER2+/ER-/PgR- y del subtipo ER+ y/o PgR+ [Banys y cols., 2012], o directamente por la diseminación del subtipo ER+ y/o PgR+ [Fehm y cols., 2009]. Pero ninguno de ellos muestra una asociación entre la presencia de CTCs y el estatus del ER en el tumor primario.

3.

Impacto pronóstico de la presencia de CTCs en

sangre periférica de pacientes con cáncer de mama Los resultados del primer trabajo experimental muestran que la detección de células CK+ en sangre periférica, antes de quimioterapia, se correlaciona significativamente con la progresión libre de enfermedad y la supervivencia global de la población [Figuras 3 y 4 del primer trabajo experimental (Capítulo 4. Resumen global de los resultados: Resultados del trabajo experimental del capítulo 1)]. Por consiguiente, con un periodo de seguimiento medio de 21 meses, la detección de células CK+ en sangre periférica parece que predice la progresión de la enfermedad de forma anticipada en pacientes con cáncer de mama. La conclusión del primer trabajo experimental incluido en esta tesis es que: la detección de células CK+ en sangre periférica antes de la quimioterapia puede identificar a pacientes con cáncer de mama con un peor pronóstico. Aunque hacen falta realizar estudios con seguimientos en el tiempo más largos y poblaciones con un mayor número de pacientes, para poder confirmar los resultados obtenidos.

222

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Tras esta publicación [Gaforio y cols., 2003], han ido apareciendo estudios cuyos resultados y conclusiones coinciden con los expuestos en esta tesis. Cristofanilli y cols. (2004; 2005) demostraron que la detección de CTCs (≥ 5 CTCs por 7,5 ml de sangre periférica) en pacientes metastásicos de cáncer de mama, antes de iniciar el tratamiento con quimioterapia, es un factor pronóstico independiente de la enfermedad. Estudios posteriores, sugieren que la cuantificación de CTCs durante el tratamiento puede ser una herramienta útil para la estratificación de los pacientes y diseñar tratamientos dirigidos [Hayes y cols., 2006; Dawood y cols., 2008]. En el caso de pacientes metastásicos de cáncer de mama, son varias las publicaciones que han demostrado el valor pronóstico de la detección de CTCs en sangre periférica, tanto antes como durante el tratamiento administrado [Pierga y cols., 2004; Budd y cols., 2006; Camara y cols., 2007; Bidard y cols., 2008a; Dawood y cols., 2008; Nolé y cols., 2008; Pierga y cols., 2012], además en este tipo de pacientes parece que la detección de DTCs no tiene el interés clínico que posee su detección en pacientes no metastásicos [Bidard y cols., 2008a; Bidard y cols., 2008b], siendo un mejor marcador la detección de CTCs [Pierga y cols., 2004; Bidard y cols., 2008a]. En cuanto a la detección de CTCs en pacientes con cáncer de mama en estadios tempranos, aunque parece predecir la recaída de la enfermedad durante el tratamiento quimioterápico [Pierga y cols., 2008], es necesario realizar más estudios para estar seguros de su valor pronóstico [Bidard y cols., 2010]. Hay que destacar dos hechos: el primero es que la Asociación Americana de Oncología (ASCO) señala en la guía de 2007 de marcadores tumorales para cáncer de mama, la detección de CTCs en sangre

223

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

periférica como un futuro marcador de diagnóstico de la enfermedad y evaluación de la terapia administrada, aunque en este momento su uso no está recomendado [Harris y cols., 2007]. En esta guía se cita el artículo publicado en 2003 [Gaforio y cols., 2003], como uno de los primeros trabajos donde se demuestra el valor pronóstico de la detección de CTCs en sangre periférica en este tipo de pacientes. Y el segundo es que la Administración de Drogas y Alimentos (FDA) acepta el uso del sistema CellSearch System (Veridex LLC, Raritan, NJ) para la monitorización de los niveles de CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer metastásico de mama, colon y próstata, y así poder evaluar la respuesta al tratamiento quimioterápico que están siguiendo.

224

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

III. UTILIDAD CLÍNICA DE

LA DETECCIÓN DE

CTCS EN SANGRE

PERIFÉRICA DE PACIENTES CON CÁNCER DE COLON

1.

Trabajos existentes sobre el tema Los primeros trabajos que hablan de la detección de células

tumorales en sangre de pacientes con cáncer colorrectal, fueron los de Engell en 1955 y 1959. En ellos se describe que existía un porcentaje alto de pacientes que presentaban CTCs en sangre en el momento de la cirugía; y supuso que debía existir una diseminación previa a ésta. Con la llegada de la PCR y la qRT-PCR, se introdujo una tecnología para el estudio de la enfermedad mínima residual muy útil [Ghossein y Rosai, 1996], de hecho la técnica más utilizada para la detección de CTCs en pacientes con cáncer colorrectal metastásico ha sido la qRT-PCR [Huang y cols., 2003; Koch y cols., 2006; Wang y cols., 2006], utilizando las CKs (sobre todo la CK20) y el antígeno carcinoembrionario (CEA) como marcadores principales. Aunque la mayor parte de los estudios utilizan marcadores múltiples para caracterizar las CTCs en sangre [Schuster y cols., 2004; Sergeant y cols., 2008; Gervasoni y cols., 2008; Tsouma y cols., 2010]. Los

estudios

de

qRT-PCR

presentan

resultados

muy

controvertidos como son: falsos positivos, la detección de los marcadores en

muestras

de

voluntarios

sanos

[Wang

y

cols.,

2006;

Vlems y cols., 2002]; rangos de detección de una amplia variabilidad, 0,8% a 100,0% [Sergeant y cols., 2008]; correlación de la presencia de las CTCs con las características biológicas del tumor primario [Huang y cols., 2003; Zhang y cols., 2005] o con un mal pronóstico de la enfermedad

225

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

[Koch y cols., 2006; Tsouma y cols., 2010]; e incluso otros estudios fallan a la hora de encontrar cualquier valor pronóstico en la detección de estas células tumorales [Wharton y cols., 1999; Vlems y cols., 2002]. Por

otro

lado,

varios

estudios

han

aplicado

técnicas

inmunológicas para la detección de CTCs en pacientes con cáncer colorrectal. Estos trabajos generalmente usan como marcador de aislamiento celular la EpCAM [Cohen y cols., 2008; Maestro y cols., 2009; Sastre y cols., 2008; Wong y cols., 2009; Wind y cols., 2009; Thorsteinsson y cols., 2011] o las CKs 7/8 [Molnar y cols., 2001; Fehm y cols., 2002], y como marcador de detección, todos emplean, las CKs. Estos trabajos muestran rangos de detección con una menor variación (5% al 75%) [Thorsteinsson y cols., 2011; Molnar y cols., 2001], que los obtenidos en los estudios que emplean técnicas moleculares. Además, varios de estos estudios inmunológicos concluyen que la detección de CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer colorrectal metastásico, tras la cirugía y antes de iniciar la quimioterapia, tiene valor pronóstico sobre la enfermedad [Cohen y cols., 2008; Cohen y cols., 2009; Wong y cols., 2009]. Como se ha indicado antes, se conoce muy poco sobre las características genéticas de las CTCs aisladas en sangre periférica de pacientes con cáncer. Solo he encontrado tres estudios que analicen las características genéticas de las CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer de colon metastásico [Fehm y cols., 2002] y no metastásico [Wind y cols., 2009; Wong y cols., 2009]. Excepto uno de los trabajos [Wind y cols., 2009], los otros demuestran que las CTCs presentan aneuploidías cromosómicas, y es más frecuente la ganancia que la pérdida de los cromosomas. Estos resultados concuerdan con los

226

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

obtenidos en CTCs aisladas de pacientes con otros tipos de tumores sólidos epiteliales, como cáncer de mama [Fehm y cols., 2002; Meng y cols., 2004a; Meng y cols., 2004b] y próstata [Fehm y cols., 2002; Swennenhuis y cols., 2009].

2.

Relación de la presencia de CTCs en sangre

periférica de pacientes con cáncer de colon con los factores pronósticos clásicos En el estudio presentado en el tercer trabajo experimental de esta tesis, se detectaron células CK+ en el 9,09% (media de 9,67 células tumorales por 10 ml de sangre periférica) de las muestras sanguíneas de los pacientes con cáncer de colon no metastásico, siempre recogiendo ambas fracciones celulares, MNC y GC. Como se ha comentado antes en el apartado de Limitaciones del estudio: Tipo y tamaño de la población de pacientes y tiempo de seguimiento, las investigaciones que centran su estudio en la detección de CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer colorrectal metastásico obtienen porcentajes de pacientes con células CK+ en sangre periférica más altos que los detectados en el tercer trabajo experimental de esta tesis. Pero, de forma general, las investigaciones que se centran en poblaciones de pacientes con cáncer colorrectal no metastásico obtienen porcentajes de pacientes con células CK+ en sangre periférica, antes de la cirugía, muy similares a los expuestos aquí.

227

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Los resultados del tercer trabajo experimental muestran que la detección de células CK+ no está correlacionada con las variables clinicopatológicas estudiadas [Tabla 1 del tercer trabajo experimental (Capítulo 4. Resumen global de los resultados: Resultados del trabajo experimental del capítulo 3)]. Resultado que concuerda con el de otros estudios realizados en el mismo tipo de pacientes [Wind y cols., 2009; Thorsteinsson y cols., 2011].

3.

Impacto pronóstico de la presencia de CTCs en

sangre periférica de pacientes con cáncer de colon La detección de CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer colorrectal metastásico parece ser un factor pronóstico de la enfermedad [Cohen y cols., 2008; Cohen y cols., 2009], pero actualmente no existen resultados

concluyentes

en

pacientes

de

estadios

tempranos

[Sastre y cols., 2008; Maestro y cols., 2009; Wind y cols., 2009; Wong y cols., 2009; Thorsteinsson y cols., 2011]. Los resultados obtenidos en el tercer trabajo experimental sugieren que, la detección de células CK+/CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer de colon no metastásico, antes de la cirugía y del tratamiento con quimioterapia, no tiene valor pronóstico sobre la enfermedad. De forma general, los resultados obtenidos por otros grupos de investigación, excepto el de Wong y cols. (2009), señalan lo mismo que se presenta en esta tesis [Wind y cols., 2009; Thorsteinsson y cols., 2011]. Por lo tanto, harían falta realizar más estudios para estar seguros del valor pronóstico de la detección de CTCs en ese tipo de pacientes.

228

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

IV. VENTAJAS DE LA TÉCNICA FICTION Y UTILIDAD CLÍNICA DE LA CARACTERIZACIÓN, GENÉTICA Y FENOTÍPICA, DE LAS CTCS EN SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES CON TUMORES SÓLIDOS EPITELIALES

1.

Ventajas de la técnica FICTION La evaluación genética y fenotípica por la técnica FICTION,

permite realizar de forma simultánea y a nivel unicelular la caracterización de las CTCs. En el estudio de las CTCs es muy importante el uso de una técnica que permita una evaluación unicelular, ya que estas células presentan una alta heterogeneidad tanto a nivel genético [Engel y cols., 1999; Fehm y cols., 2002; Swennenhuis y cols., 2009] como fenotípico [Fehm y cols., 2002; Mikolajczyk y cols., 2011; Königsberg y cols., 2011]. La técnica FICTION supone una gran ventaja con respecto a la evaluación genética por FISH, ya que para realizar esta última es necesario la destrucción de la membrana celular y relocalizar las células para su evaluación, lo que conlleva tiempo y la pérdida de células evaluables, como ocurre en algunos estudios publicados [Swennenhuis y cols., 2009]. Por el contrario, la técnica FICTION no daña la membrana celular lo que permite realizar una segunda evaluación de otros marcadores en la célula de interés, tanto realizando un FICTION doble [Weber-Matthiesen y cols., 1993] como una marcación por ICC, como es el caso del tercer trabajo experimental presentado en esta tesis. Posibilitando de esta forma realizar una mejor caracterización fenotípica de las CTCs, lo que podría ser útil para el estudio del proceso tumoral, una

229

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

mejor clasificación de los pacientes y permitir buscar nuevas dianas terapéuticas en estas células tumorales. En cuanto a la comparación de la técnica FICTION con las técnicas de detección de CTCs moleculares, solo cabe decir que la diferencia básica y la ventaja fundamental que presenta el FICTION es que permite la evaluación de la célula tumoral in situ, y no a través de marcadores sin la visualización de la célula de interés.

2.

Utilidad clínica en cáncer de mama La técnica descrita en el segundo trabajo experimental de esta

tesis, se podría aplicar para la detección precoz de CTCs que porten amplificación de ERBB2/TOP2A, sobre todo en el caso de pacientes con cáncer de mama. De esta forma se podría monitorizar, de una forma relativamente simple, la respuesta a terapias con trastuzumab y antraciclinas. Sin embargo, lo primero que habría que hacer es comprobar la validez clínica de esta metodología en muestras clínicas de pacientes. Hay que tener en cuenta que actualmente se desconoce si las amplificaciones o deleciones de ERBB2/TOP2A que encontramos en las CTCs podrían representar un patrón general de las aberraciones del tumor primario. Como, la amplificación de ERBB2 que aparece en aproximadamente el 20% al 35% de los cánceres de mama invasivos; o la modificación de la TOP2A, que se ha encontrado alterada en el 90% de los tumores que presentan ERBB2 amplificado, aunque algunos tumores que presentan copias extras de ERBB2 muestran amplificación o deleción de TOP2A [Järvinen y cols., 1999]. Esto podría tener implicaciones terapéuticas, ya que deleciones en TOP2A confieren resistencia a los inhibidores de la topoisomerasa II [Järvinen y Liu, 2003], por lo que se

230

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

podría explicar la pérdida gradual de eficacia, común en cáncer de mama, de este tipo de tratamientos. Hay estudios que han demostrado la adquisición de la expresión de HER2 en las CTCs durante la progresión tumoral [Meng y cols., 2004a; Fhem y cols., 2007; Fehm y cols., 2010]. Sin embargo, otros estudios han demostrado que tanto el tumor primario como las metástasis presentan un estado similar para este gen [Tanner y cols., 2001; Dirix y cols., 2005]. Teniendo en cuenta esto, uno podría pensar que las CTCs proceden de un subclon de células tumorales que no debe ser una muestra representativa de todo el tumor. Aunque no se conozca si las CTCs presentan exactamente un patrón general de las aberraciones del tumor primario o si son un subclon de células tumorales no representativas de éste, sabemos que en ellas puede aparecer una variación tanto del genotipo como del fenotipo respecto a lo detectado en el del tumor primario, como es la amplificación de ERBB2 [Meng y cols., 2004a; Meng y cols., 2006] y la expresión de HER2, ER y PgR [Meng y cols., 2004a; Meng y cols., 2006; Fehm y cols., 2007; Fehm y cols., 2009; Fhem y cols., 2010; Somlo y cols., 2011; Banys y cols., 2012;]. Basándose en este genotipo y fenotipo diferencial de las CTCs, hay varios trabajos que las han utilizado como diana terapéutica, por ejemplo: Meng y cols. (2004a) administraron trastuzumab a 4 pacientes con cáncer de mama cuyo tumor primario era HER2- pero sus CTCs aisladas presentaban amplificación del gen ERBB2, y obtuvieron una remisión completa de la enfermedad en uno de los casos y parcial en dos de ellos; Liu y cols. (2010) sometieron a una paciente con cáncer de mama, cuyas CTCs presentaban expresión de EGFR y su tumor primario no (solo el 2% lo expresaba), a una terapia con capecitabina y

231

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

lapatinib (anti-EGFR/HER2), tras la cual se monitorizó el nivel de CTCs que expresaban EGFR, y sus resultados mostraron como: en las primeras semanas, se produjo una disminución de 8 veces en el número de CTCs, además de una disminución del 50% del tumor; tras nueve semanas de tratamiento, no se detectaron CTCs y se produjo una reducción de las lesiones tumorales del 80%; tras 18 semanas de tratamiento aparece un aumento del marcador CA 15.3 y se detectan 2 CTCs EGFR-, y este resultado se mantuvo tras 30 y 42 semanas de tratamiento. Estos dos ensayos demuestran, cómo es posible utilizar la detección y caracterización, genética y fenotípica, de las CTCs para definir los tratamientos opcionales que pueden emplearse de forma personalizada en las pacientes con cáncer de mama y monitorizar el número de estas células, positivas para una diana específica, para comprobar la eficacia de dicha terapia. Aunque la metodología descrita en el segundo trabajo experimental

de

esta

tesis,

se

centra

en

la

evaluación

de

ERBB2/TOP2A/CEP17 en líneas celulares, se pueden emplear otras dianas de estudio con esta misma técnica. Por ejemplo, las pacientes con cáncer de mama N0 que portan una deleción 11q parece que pueden beneficiarse

de

[Climent y cols., 2007].

232

una

terapia

basada

en

antraciclinas

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

3.

Utilidad clínica en cáncer de colon Para poder corroborar el valor clínico de la caracterización,

genética y fenotípica, de las CTCs en muestras clínicas, se ha aplicado la metodología publicada en 2008 [Campos y cols., 2008] en una población de 33 pacientes con cáncer de colon no metastásico. Después de obtener que el 9,09% (3/33) de los pacientes presentaban CTCs en sus muestras sanguíneas, se enfocó el estudio en el paciente IN28, ya que sus CTCs presentaban características distintas al tumor primario, lo que podría indicar el valor pronóstico de la caracterización de estas células tumorales en la progresión tumoral. El tumor primario del paciente IN28 (paciente en estadio II) era un adenocarcinoma infiltrativo sin nódulos linfáticos comprometidos y sin metástasis a distancia, que se caracterizó por: una marcación intensa para Ki67 y ciclina D1; una marcación difusa con intensidad moderada para MMP9 (dato no mostrado); una marcación, prácticamente, negativa para p53; y la no expresión de COX-2, MMP2 (datos no mostrados) y HER2 [Figura 4 del tercer trabajo experimental (Capítulo 4. Resumen global de los resultados: Resultados del trabajo experimental del capítulo 3)]. Los análisis FISH de las secciones del tumor primario demostraron disomía para el cromosoma 17 y para el gen ERBB2. En este paciente se aislaron un total de 26 CK+/CTCs en sangre periférica. Estas células tumorales resultaron ser una población celular heterogénea, tanto para las características genéticas como fenotípicas estudiadas. Las CK+/CTCs presentaron dos patrones genéticos básicos: un patrón predominante (88,46%), que era trisómico para el cromosoma 17; y un patrón, menos común, que era disómico para este cromosoma

233

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

(11,54%). En general, ambas poblaciones de CK+/CTCs presentaron 2 copias para el gen ERBB2 (80%), y no se detectó amplificación del mismo. En cuanto a sus características fenotípicas, y en contraste con los resultados obtenidos en el análisis genético, resultó que el 61,90% de las CK+/CTCs sobreexpresaba la proteína HER2, 63,33% si se tienen en cuenta las CK-/CTCs detectadas en la muestra, otra característica fenotípica de esta población de CTCs (variación de la expresión de las CKs estudiadas). La expresión de la proteína HER2, en estas CTCs, puede estar relacionada con la ploidía del cromosoma 17, como indican varios estudios realizados en cáncer de mama [Salido y cols., 2005; Ma y cols., 2005]. El hallazgo de una población, genética y fenotípicamente, heterogénea de CTCs en la misma muestra de sangre periférica, está en consonancia con los resultados obtenidos en pacientes metastásicos con cáncer de colon [Fehm y cols., 2002], próstata y mama [Fehm y cols., 2002; Mikolajczyk y cols., 2011]. El hecho de que las CTCs del paciente IN28 presenten sobreexpresión de la proteína HER2 (HER2+/CTCs), mientras que su tumor primario no lo haga, puede ser explicado porque estas CTCs provengan de un subclon de células tumorales inusual que no es fácilmente detectable en la biopsia del tumor primario. Aunque una explicación alternativa podría ser que las CTCs que expresan HER2 de novo, adquieren ventajas para metastatizar. Esta idea no es contradictoria con los datos que se barajan de cáncer de mama, donde se ha descrito como la sobreexpresión de HER2 puede ser adquirida durante la progresión tumoral: las CTCs pueden expresar HER2 aunque su tumor primario haya sido considerado HER2- [Meng y cols., 2004a; Fehm y cols., 2007; Fehm y cols., 2010]; y se ha comprobado que la detección de CTCs con HER2+ (HER2+/CTCs), está asociada a un peor pronóstico de la enfermedad [Wülfing y cols., 2006].

234

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Indiscutiblemente, solo con los datos del tercer trabajo experimental no se puede concluir que los pacientes con cáncer de colon que presenten HER2+/CTCs deban ser tratados con trastuzumab (Herceptin). Sin embargo, existen antecedentes en cáncer de mama donde se han utilizado terapias dirigidas frente a CTCs, según la expresión de proteínas en la superficie de estas células [Meng y cols., 2004a; Liu y cols., 2010], que han obtenido resultados en la respuesta al tratamiento aplicado (como una respuesta completa, o parcial e incluso la disminución de las lesiones metastásicas) indicando que estas células se pueden utilizar con este fin. Actualmente, no existen estudios de este tipo en pacientes con cáncer de colon, por lo que solo podemos suponer una utilidad igual que en el caso de cáncer de mama. En la actualidad, las características del tumor primario son el estándar más utilizado para la clasificación de pacientes y la toma de decisión del tratamiento que van a recibir. La terapia adyuvante estándar en cáncer colorrectal está basada en la asociación del 5-fluorouracilo con levamisole

y/o

leucovorin

[Watanabe

y

cols.,

2001;

Chau y Cunningham, 2002]. La primera línea de tratamiento que se usa en los casos avanzados consiste en la asociación de la terapia adyuvante estándar con nuevas drogas más reactivas, como irinotecan, oxaliplatino y fluoropirimidinas orales [Benson, 2007; Comella y cols., 2009; Hebbar y cols., 2009]; y la combinación de estos tratamientos con anticuerpos

monoclonales

(Cetuximab

o

Bevacizumab)

[Cunningham y cols., 2004; Hurwitz y cols., 2009].

235

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Debemos tener en cuenta que la inestabilidad genética del tumor [Goel y cols., 2003; Grady, 2004; Samowitz y cols., 2007] hace que una fracción de células tumorales continúe mutando, dando lugar a variantes que

son

resistentes

a

los

regímenes

de

terapia

usados

[Jhawer y cols., 2008; Jiang y cols., 2009]. Estas resistencias al tratamiento que aparecen hacen que se busquen nuevas terapias, lo más específicas posibles, por ejemplo aquellas que usan como diana alteraciones génicas específicas, como pueden ser: •

alteraciones en el protooncogen C-MYC (localizado en el cromosoma 8) que codifica un factor de transcripción y es una de las oncoproteínas más frecuentemente desreguladas en los tumores malignos [Facchini y Penn, 1998];



alteraciones en ERBB2 (localizado en el cromosoma 17), miembro de la familia EGFR, que es una diana común en cáncer de mama [Slamon y cols., 2001; Madarnas y cols., 2008]. Varias investigaciones han demostrado que este gen se encuentra sobreexpresado o amplificado en otros tipos de tumores, como: cáncer de pulmón, gástrico y colorrectal [Nathanson y cols., 2003; Takenaka y cols., 2011; Tsapralis y cols., 2012]; exactamente, del 3% al 14% de los tumores primarios colorrectales presentan sobreexpresión o amplificación de ERBB2 [Nathanson y cols., 2003; Al-Kuraya

y

cols.,

2007;

Dursun

y

cols.,

2001;

Kavanagh y cols., 2009], y esto nos permitiría emplear terapias antiHER2, como el trastuzumab y lapatinib, en esta subpoblación de pacientes [Kuwada y cols., 2004; Langer y cols., 2004; Park y cols., 2007; Tapia y cols., 2007; Al-Kuraya y cols., 2007; Kavanagh y cols., 2009; Kelly y cols., 2010; Javle y Hsuech, 2010;

236

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

Choi y cols., 2011; Morishita y cols., 2010]. De hecho, aunque no esté aprobado el uso de terapias anti-HER2 en pacientes con cáncer de colon, se están realizando estudios clínicos para evaluar la eficacia de estos tratamientos en la población de pacientes HER2+. Los resultados obtenidos en esta tesis, junto con los de otros grupos de investigación [Meng y cols., 2004a; Meng y cols., 2006; Fehm y cols., 2007; Fehm y cols., 2010; Liu y cols., 2010], sugieren que el análisis patológico del tumor primario no debería ser el único estándar utilizado para aplicar un tratamiento específico tras la operación, ya que la caracterización, genética y fenotípica, de las CTCs aporta una información adicional a éste. De esta forma se podría combinar tanto la información ofrecida por el tumor primario como las CTCs, a la hora de la clasificación y la toma de decisión del tratamiento a seguir en pacientes con tumores sólidos epiteliales. Según los resultados obtenidos en los pacientes con cáncer de colon se puede decir que: (i) La caracterización de las CTCs por la técnica FICTION, de forma individual, hecho que es importante debido a la heterogeneidad que presentan estas células, puede aportar información adicional a la obtenida por los métodos patológicos convencionales, y completar el diagnóstico de la enfermedad; (j) La triploidía del cromosoma 17 y la sobreexpresión de la proteína HER2, pueden aparecer en las CTCs de pacientes con cáncer de colon, en estadios tempranos.

237

Discusión general Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

En resumen, en esta tesis se presenta una metodología que inicialmente solo permitía el aislamiento y cuantificación de CTCs en sangre periférica de pacientes con tumores sólidos de origen epitelial [Gaforio y cols., 2003], y que posteriormente fue modificada y permitió analizar estas células tumorales tanto genética como fenotípicamente de forma simultánea [Campos y cols., 2008], sin la necesidad de destruir la membrana celular y realizar una relocalización de las células, lo que ocurre con la técnica FISH y se traduce en consumo de tiempo y pérdida de células evaluables. Además, se expone el valor pronóstico que tiene la detección de CTCs en pacientes con cáncer de mama, tanto sobre el tiempo libre de enfermedad como en la supervivencia global, y cómo la detección de estas células tumorales señala una población de pacientes con un mal pronóstico de la enfermedad en los que se incluyen pacientes cuyo tumor primario es ER+ [Gaforio y cols., 2003]. Se incluyen además, los resultados preliminares de un estudio realizado en pacientes con cáncer de colon no metastásico donde, aunque parece que este marcador no tiene valor predictivo, el hecho de emplear una técnica tan versátil como la desarrollada en 2008 [Campos y cols., 2008] ha permitido comprobar que las CTCs aportan información diferente y complementaria a la que ofrece el estudio anatomopatológico del tumor primario.

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CONCLUSIONES

Conclusiones Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

I.

Se ha desarrollado una metodología que permite de forma individualizada: aislar, cuantificar y estudiar, genética y fenotípicamente, las células tumorales circulantes (CTCs) en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama y cáncer de colon.

II.

La detección de CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama antes del tratamiento con quimioterapia puede identificar un subgrupo de pacientes con un peor pronóstico de la enfermedad.

III.

La detección de CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer de colon no metastásico, antes de la cirugía y del tratamiento con quimioterapia, no es un marcador pronóstico de la enfermedad. Pero hacen falta realizar más estudios para poder corroborar esta conclusión.

IV.

El análisis individualizado, de las características genéticas y fenotípicas, de las CTCs aisladas de sangre periférica, aporta información sobre el proceso metastásico. Lo que nos permite ofrecer información adicional al análisis patológico convencional del tumor.

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characterization

of

circulatingtumor

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transcripts

versus

the

combined

cytology

with

peritoneal

carcinoembryonic antigen levels. Cancer Lett. 2005;223(1):129-35. Wang JY, Wu CH, Lu CY, Hsieh JS, Wu DC, Huang SY and Lin SR. Molecular detection of circulating tumor cells in the peripheral blood of patients with colorectal cancer using RT-PCR: Significance or prediction of postoperative metastasis. World J Surg. 2006;30(6):1007-13. Wang S, Liu K, Liu J, Yu ZT, Xu X, Zhao L, Lee T, Lee EK, Reiss J, Lee YK, Chung LW, Huang J, Rettig M, Seligson D, Duraiswamy KN, Shen CK and Tseng HR. Highly efficient capture of circulating tumor cells by using nanostructured silicon substrates with

integrated

chaotic

micromixers.

Angew

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Int

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prostate

cancer:

Detection

and

prognostic

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cancer

patients

predict

unfavorable

clinical

outcome.

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circulating

tumor

cell

(CTC)

enrichment

from

blood.

Biomed Microdevices. 2011;13(1):203-13. Zia A, Schildberg FW and Funke I. MHC class I negative phenotype of disseminated tumor cells in bone marrow is associated with poor survival in R0M0 breast cancer patients. Int J Cancer. 2001;93(4):566-70.

304

ANEXOS

Anexos Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

ANEXO 1: CLASIFICACIÓN DE PUBLICADO

LAS REVISTAS EN LAS QUE SE HAN

LOS

RESULTADOS

DEL

TRABAJO

EXPERIMENTAL DE LA TESIS, OBTENIDO DEL

JCR

SCIENCE EDITION En este Anexo 1 se adjuntan los resúmenes de las clasificaciones de las revistas: - International Journal of Cancer; - Journal of Histochemistry and Cytochemestry. Correspondientes

a

las

publicaciones

realizadas

en

el trabajo

experimental de esta tesis, obtenidas del Journal Citation Reports (2010 JCR Science Edition). También se adjunta el resumen de la clasificación de la revista BMC Cancer, a la cual se ha enviado el trabajo experimental expuesto en el tercer capítulo de Trabajo experimental y Resumen global de los resultados de esta tesis, para su publicación.

307

2010 JCR Science Edition

Rank in Category: INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER Journal Ranking For 2010, the journal INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER has an Impact Factor of 4.926. This table shows the ranking of this journal in its subject categories based on Impact Factor. Category Name

ONCOLOGY

Total Journals Journal Rank Quartile in Category in Category in Category

185

32

Q1

Category Box Plot For 2010, the journal INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER has an Impact Factor of 4.926. This is a box plot of the subject category or categories to which the journal has been assigned. It provides information about the distribution of journals based on Impact Factor values. It shows median, 25th and 75th percentiles, and the extreme values of the distribution.

Key

A - ONCOLOGY

Acceptable Use Policy Copyright © 2012 Thomson Reuters.

2010 JCR Science Edition

Rank in Category: JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY & CYTOCHEMISTRY Journal Ranking For 2010, the journal JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY & CYTOCHEMISTRY has an Impact Factor of 2.381. This table shows the ranking of this journal in its subject categories based on Impact Factor. Category Name

CELL BIOLOGY

Total Journals Journal Rank Quartile in Category in Category in Category

178

116

Q3

Category Box Plot For 2010, the journal JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY & CYTOCHEMISTRY has an Impact Factor of 2.381. This is a box plot of the subject category or categories to which the journal has been assigned. It provides information about the distribution of journals based on Impact Factor values. It shows median, 25th and 75th percentiles, and the extreme values of the distribution.

Key

A-

Acceptable Use Policy Copyright © 2012 Thomson Reuters.

CELL BIOLOGY

2010 JCR Science Edition

Rank in Category: BMC CANCER Journal Ranking For 2010, the journal BMC CANCER has an Impact Factor of 3.153. This table shows the ranking of this journal in its subject categories based on Impact Factor. Category Name

ONCOLOGY

Total Journals Journal Rank Quartile in Category in Category in Category

185

66

Q2

Category Box Plot For 2010, the journal BMC CANCER has an Impact Factor of 3.153. This is a box plot of the subject category or categories to which the journal has been assigned. It provides information about the distribution of journals based on Impact Factor values. It shows median, 25th and 75th percentiles, and the extreme values of the distribution.

Key

A - ONCOLOGY

Acceptable Use Policy Copyright © 2012 Thomson Reuters.

Anexos Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

ANEXO 2: APORTACIÓN EXTRAORDINARIA RELEVANTE, PONENCIA EN CONGRESO INTERNACIONAL En 2010, recibí una invitación a ser ponente

en la

“10th Euroconference on Clinical Cell Analysis of the European Society for Clinical Cell Analysis (ESCCA) and the Iberian Society for Cytometry (SIC)”, congreso internacional desarrollado en Valencia. De la cual adjunto el resumen de la misma, con título “Detection of Circulating Tumor Cells in human

breast

cáncer”,

publicado

en

la

revista

internacional

Cytometry Part B (Clinical Cytometry), de la cual se adjunta el resumen de su clasificación obtenida del Journal Citation Reports (2010 JCR Science Edition). -

Índice de impacto de la revista = 2,307

-

Categoría a la que pertenece: Patología y Medicina Forense

-

Cuartil: segundo cuartil

-

Rango que ocupa: 37/76 y 12/31

315

Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 78B:406–459 (2010)

ESCCA and SIC 2010 Abstracts

Abstracts from the 10th Euroconference on Clinical Cell Analysis of the European Society for Clinical Cell Analysis (ESCCA) and the Iberian Society for Cytometry (SIC) PLE-1-01 THE EU-FUNDED EUROFLOW PROJECT (LSHB-CT-2006-018708): BACKGROUND, CURRENT ACHIEVEMENTS AND FUTURE PERSPECTIVES Jacques J.M. van Dongen,1 Alberto Orfao2 1

Erasmus MC, ROTTERDAM, The Netherlands 2 Cytometry Service, Dept of Medicine & Cancer Research Centre, University of Sala, SALAMANCA, Spain Flow cytometric immunophenotyping is widely used for the diagnosis, classification, and monitoring of hematological malignancies. However, molecular techniques have a strong position for classification and monitoring of residual disease, despite several major disadvantages, such as their labor-intensive and time consuming character, limited applicability and no focus on cell populations within a sample, unless preceding purification steps are performed. These limitations can be overcome by innovations in flow cytometry immunophenotyping because this technology fulfills the requirements of high speed, accurate focusing on malignant cell population as well as broad applicability for the diagnosis and follow-up of virtually all hematological malignancies. Consequently, the EuroFlow Consortium worked for 4 years on several Work Packages with special focus on: 1) the development of new antibodies for the detection of intracellular (onco)proteins, 2) application of a novel immunobead technology for fast and easy detection of fusion proteins for classification of acute leukemias, 3) the development of new software tools for easy and reproducible data analysis, 4) the design and evaluation of 8-color antibody panels and instrument set-up procedures for the diagnosis, classification and monitoring of patients with different types of hematological diseases. The combination of panels and software tools allows easy evaluation of the immunophenotypic profile of a given cell population against reference data of multiple normal and pathological samples stained with the same antibody panels. This work was performed by 14 academic diagnostic teams and 2 small-sized biotech companies.

PLE-1-02 EUROFLOW DESIGN OF SOFTWARE TOOLS TO BUILD MULTICOLOR ANTIBODY PANELS FOR LEUKEMIA/LYMPHOMA PHENOTYPING Alberto Orfao,1 Quentin Lecrevisse,1 Elaine S. Costa,2 Carlos E. Pedreira,3 Marta Martin,4 Juan Hernandez,4 Miguel Mun˜oz,4

q 2010 International Clinical Cytometry Society

Juan Flores-Montero,1 Julia Almeida,1 Sebastian Bottcher,5 Ludovic Lhermite,6 Tomas Kalina,7 Lukas Sedek,8 Vincent H.J. van der Velden,9 Matthew Cullen,10 Paulo Lucio,11 Jacques J.M. van Dongen,9 EuroFlow Consortium12 1

University of Salamanca, SALAMANCA, Spain Instituto de Pediatria e Puericultura Martaga˜o Gesteira and Departamento de Clı´n, RIO DE JANEIRO, Brazil 3 Faculty of Medicine and COPPE - Engineering Graduate Program, UFRJ/Federal Univ, RIO DE JANEIRO, Brazil 4 Cytognos SL, SALAMANCA, Spain 5 University Klinik Scheswig-Holstein, KIEL, Germany 6 Hopital Necker, PARIS, France 7 Charles University, PRAGUE, Czech Republic 8 Medical University of Silesia, ZABRZE, Poland 9 University Medical Center Rotterdam, ROTTERDAM, The Netherlands 10 St James University Hospital, LEEDS, United Kingdom 11 Instituto Portugues de Oncologia, LISBON, Portugal 12 Spain In recent years, the EuroFlow Consortium has developed new and unique tools which can be applied to a more comprehensive and objective evaluation of the performance of multicolor antibody panels, for example, leukemia/lymphoma phenotyping. The new strategy is based on the transformation of a set of 2 data files containing information about the same sample into a single data file. If the merged data files correspond to different stainings of the same sample containing common backbone parameters that allow unequivocal identification of the cell populations of interest in that sample, merging of the data files can be followed by an accurate calculation of the ‘‘missing values’’. As a result, all individual events from each of the original data files will contain information about each reagent in the whole panel evaluated in all aliquots stained for the same sample. Based on this strategy, one or more cell populations from one or multiple samples can now be compared with other (e.g. reference) cell populations from one, or a pool of 2 different samples. To a certain extent, this allows objective comparison of the immunophenotypic profiles 2

Published online in Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com) DOI: 10.1002/cyto.b.20563

418

ESCCA AND SIC 2010 ABSTRACTS

CD161. In humans, two major subsets of natural killer T cells have been described. The more widely studied subset are the invariant NKT cells (or type I), which express a highly restricted T cell receptor with an invariant V 24J 18 chain, preferably paired with V 11, and are dependent on the presentation of the glycolipid antigen through CD1d, a member of class I non-polymorphic antigen presenting molecules. The second class of NKT cells (or type II), CD1d- independent cells, expresses a TCR / repertoire and is independent of CD1d for their activity. We recently demonstrated the expansion of pulmonary NKT cells in patients with hypersensitivity pneumonitis. The major NKT phenotype in hypersensitivity pneumonitis was non-biased CD3þCD8þCD56þ. Furthermore, NKT cells might contribute to the amplified and prolonged CD4-positive Th1 response that characterizes sarcoidosis. We showed significant reduction of invariant NKT cells both in the lung and in peripheral blood of patients with sarcoidosis. Moreover, we demonstrated that this deficiency was associated with changes in SLAM/SAP signaling, which is a major pathway involved in invariant NKT cell development. Finally, we recently closely followed the progress of invariant NKT cells and SLAM/SAP signaling in the peripheral blood of patients with sarcoidosis and in control subjects over a long period.

PAR-3E-02 T CELL ACTIVATION IN EXACERBATIONS OF REFRACTORY ASTHMA Antoine Magnan,1 Karine Botturi-Cavaille`s2 1

L’Institut du Thorax, NANTES, France INSERM, NANTES, France Refractory asthma is an ultimate form of asthma defined by a high frequency of exacerbations in patients already treated with high doses of inhaled steroids, long acting beta-2 agonists and frequently oral corticosteroids. Severe exacerbations represent the main issue in refractory asthma management, inducing heavy costs, leading to emergency care requirement and, all too often, intensive care treatment and ultimately, death. It is therefore necessary to dispose of valid early markers of exacerbations, robust enough to intensify the asthma treatment before symptoms. Asthma results from an inflammatory reaction mainly driven by Th2 cells and eosinophils. Exacerbations are triggered by allergens, pollutants and viruses. Induced sputum is an easy and safe procedure to collect bronchial cells and can be repeated in the same subjects longitudinally. We performed a study in induced sputum from refractory asthmatics to detect whether a change in T cell cytokine production could predict an exacerbation. Samples were obtained in stable state before, during and after 16 exacerbations in 30 patients. Blood samples were taken concomitantly. IFN-g, IL-4, IL-5, IL-13 T cell production was detected by flow cytometry in T cells and in the CD8þ subset. A mixed Th1/Th2 activation was detected before exacerba2

tions that lasted during exacerbations but returned to baseline thereafter. A similar profile was observed in blood and induced sputum. A new study is in process to validate the blood T cell activation as a biomarker, taking viral infections into account. This study was sponsored by the Programme Hospitalier de Recherche Clinique, INSERM, and Re´gion Pays de La Loire.

PAR-3E-03 CELLULAR IMMUNITY AGAINST TB IN BLOOD AND BRONCHOALVEOLAR LAVAGE FLUID Simon Barry

University Hospital LLandough, CARDIFF, United Kingdom In the majority of cases tuberculosis (TB) is controlled by the human host and only approximately 10% of asymptomatic infected individuals develop active TB disease over their lifetime. The fact that HIV co-infection, which selectively depletes CD4þ T cells, increases this chance of reactivation from 10% per lifetime to 10% per annum emphasises the role of immunoregulation of TB. Furthermore, studies of knockout mice that lack the capacity to generate type-I cytokine responses, together with rare cases of humans lacking IL-12 and IFN-g receptors, have highlighted the most important mechanisms involved in immune control. It is well appreciated that mycobacterium tuberculosis is usually acquired by inhalation and results in predominantly respiratory disease. It follows that anti-TB defences will concentrate at the site of infection and that the focus of investigation should be lung based. Flow cytometry, investigating functional lung T lymphocyte responses following short term incubation with TB antigens, is the optimum tool for studying the immune response to TB. It has been demonstrated that lung CD4þ T lymphocyte IFN- and TNF- responses following incubation with purified protein derivative (PPD) were 300 fold greater than in the blood. A dominant lung CD4þ T lymphocyte response is also seen in non-pulmonary TB. Interestingly, prior BCG vaccination does not influence the lung responses to PPD, unlike in the blood where the discriminatory RD-1 antigens, ESAT-6 and CFP-10 must be used. In subjects with advanced, cavitary lung disease, there is a waning of the lung lymphocyte responses and an accompanying neutrophilia, perhaps indicative of a loss of immune control.

PAR-3S-01 DETECTION OF CIRCULATING TUMOR CELLS IN HUMAN BREAST CANCER Marı´a Campos, Jose´ Juan Gaforio, Fernando Warleta, Cristina Sa´nchez-Quesada

University of Jae´n, JAE´N, Spain Breast cancer (BC) is the most frequent type of cancer and the third highest cause of cancer death in European women because of its high incidence and good prognosis.

Cytometry Part B: Clinical Cytometry

ESCCA AND SIC 2010 ABSTRACTS

Frequently, death results from the development of metastases. BC has been shown to shed tumor cells into the circulation, even at the earliest stages of primary tumor development, and these cells have been isolated in peripheral blood (PB) and in bone marrow. Pretlow et al. (2000) have demonstrated that Circulating Tumor Cells (CTCs) isolated from PB of cancer patients are able to develop metastasis. Thus, the early detection of CTCs may have important therapeutic and prognostic implications. Nowadays, it has been demonstrated that bone marrow tumor cell detection in BC is a known prognostic factor for disease-free and overall survival, and the detection of CTCs in PB has clinical relevance, not just as an indicator of overall survival, but also as disease progression, as confirmed by our group. In short, our results showed that CTCs cells in PB were identified in 62% of BC patients. There were significant differences in the presence of CTCs according to estrogen receptor expression (p¼0.049), and lymph node status (p¼0.033), but not to other characteristics. The median follow-up was 21 months and the detection of CTCs, before starting the chemotherapy, in these patients was significantly correlated with progression-free survival (p¼0.058) and overall survival (p¼0.003). Recently, we published a novel method enabling simultaneous immunophenotyping and genetic analyses of CTCs. This could be useful for a better classification of patients according to genetic features of CTCs and for the application of specific therapies.

PAR-3S-02 MINIMAL RESIDUAL DISEASE IN HEMATOLOGICAL MALIGNANCIES Neus Villamor

Unitat d’Hematopatologia, Hospital Clinic de Barcelona, BARCELONA, Spain Multiparametric flow cytometry (MFC) plays a major role in the diagnosis of hematological malignancies and is becoming more important in the evaluation of the response. The persistence/reappearance of submicroscopic leukemic cells is an important post-treatment prognostic factor for the outcome of patients with acute leukemia (AL), chronic lymphocytic leukemia (CLL) and multiple myeloma (MM). The MFC assay for MRD is generally less sensitive than molecular techniques, but it is also less complex. The detection of leukemic associated phenotype (LAIP) is the basisof MRD assay. The use of 4 antigenic combinations with core and specific markers allows a sensitivity of 0.01% abnormal cells in the majority of acute lymphoblastic leukemia, CLL and MM patients. This sensibility is only obtained in half the cases with acute myeloblastic leukemia. The most important source of false positive and negative results in the MRD assay in patients with AL is the presence of leukemic subpopulations at diagnosis, changes induced by therapy and phenotypic shifts during follow-up. Although MRD results are used to stratify patients with AL in post-induction therapy, the clinically relevant time-points

Cytometry Part B: Clinical Cytometry

419

and cut-off values have not been clearly established. In CLL or MM, a MRD test reaching a sensitivity of at least 0.01% is required to consider a patient to be in CR MRD negative. In hematological diseases, the criteria of CR is moving from morphology to MRD, and the challenge in the future is the standardization of methodology and terminology for MRD detection in each type of disease and to provide a common base for clinicians to compare results between different clinical trials.

PAR-3S-03 POLYCHROMATIC FLOW CYTOMETRY STUDIES OF DENDRITIC CELLS AND MONOCYTES IN AUTOINMUNE DISEASES. Jorge Monserrat,1 Miguel Angel Sanchez,2 Ana Sanchez Atrio,3 Ana Perez,3 Maria Jose Leon,3 Luis Chara,2 David Diaz,2 Hugo Barcenilla,2 Zaida Moreno,2 Alfredo Prieto,2 Eduardo Reyes,2 Melchor Alvarez-Mon3 1

Universidad de Alcala, ALCALA DE HENARES, Spain Lab. de enfermedades del S. Inmune. Dto. Medicina. F. Medicina. UAH. CSIC/IMMPA, ALCALA´ DE HENARES, Spain 3 Servicio de enfermedades del Sistema Inmune (ESI). Hospital Principe de Asturias, ALCALA´ DE HENARES, Spain Dendritic cell (DCs) and monocyte studies have been demonstrated to be important for the compression of the different mechanisms in human pathologies. Newer markers appear in peripheral blood which study their distribution and activation stage. Objective: By using polychromatic flow cytometry in 11 colors, we have studied the distribution and activation subsets of monocytes and DCs in peripheral blood from autoimmune diseases patients with or without biological treatments (anti-TNF ). Methods: We have studied peripheral blood monocytes and DCs from patients with rheumatoid arthritis (RA), ´ s Disease and healthy controls. For surface labeling Crohn antibodies against the antigens on monocytes we used: CD(3,56,19,14,16,62L,11b), Slan, HLA-DR, CX3CR1 and dead cells exclusion probe; and on DCs: CD(3,56,19,14,16,11c,1c,62L,11b), HLA-DR, CX3CR1 and dead cells probe. We acquired in a FacsAria. Results: We found significant differences in the number of plasmacytoid and myeloid I cells that were decreased in RA and Crohn patients with regard to healthy controls. After 12 months of anti-TNF treatment, the levels were normalized in both groups of patients. Myeloid cells and plasmacytoid cells showed a significant decrease in the CD62LþCX3CR1þ and CD11bþCD62Lþ expression respectively, with a significant increase after 12 months of treatment. In monocytes, we found that RA and Crohn patients showed a decrease of classical monocytes defined CD14BrþCD16- and showed an increase of transition subsets defined by CD14BrþCD16Br/Lwþ. Conclusions: Anti-TNF treatment is able to normalize the distribution and activation stage of peripheral blood monocytes and DCs in RA and Crohn patients. 2

2010 JCR Science Edition

Rank in Category: CYTOMETRY PART B-CLINICAL CYTOMETRY Journal Ranking For 2010, the journal CYTOMETRY PART B-CLINICAL CYTOMETRY has an Impact Factor of 1.960. This table shows the ranking of this journal in its subject categories based on Impact Factor. Total Journals Journal Rank Quartile in Category in Category in Category

Category Name

MEDICAL LABORATORY TECHNOLOGY

31

12

Q2

PATHOLOGY

76

37

Q2

Category Box Plot For 2010, the journal CYTOMETRY PART B-CLINICAL CYTOMETRY has an Impact Factor of 1.960. This is a box plot of the subject category or categories to which the journal has been assigned. It provides information about the distribution of journals based on Impact Factor values. It shows median, 25th and 75th percentiles, and the extreme values of the distribution.

Key

MEDICAL A - LABORATORY TECHNOLOGY B - PATHOLOGY

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Anexos Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

ANEXO 3: APORTACIONES, REFERENTES AL TEMA DE LA TESIS, PRESENTADAS EN CONGRESOS INTERNACIONALES QUE CONLLEVAN PUBLICACIÓN EN REVISTAS DE ALTO IMPACTO En 2007 se realizó una aportación al congreso “2007 American Society of Clinical Oncology (ASCO) Annual Meeting”, cuya referencia se detalla

más

adelante,

publicada

en

la

revista

internacional

Journal of Clinical Oncology. -Índice de impacto de la revista = 18,970 - Categoría a la que pertenece: Oncología - Cuartil que ocupa: primer cuartil - Rango en la categoría (2010): 4/185 Publicación: Serrano M, Sánchez-Rovira P, Campos M, Warleta F, Ruiz-Mora J, Algarra I, Delgado-Rodríguez M, Fernández M, de la Torre C, Peiró A and Gaforio JJ. Persistence of circulating tumour cells after treatment predicts clinical outcome in breast cancer patients. J Clin Oncol. (Meeting Abstracts) 2007; 25(18S, 20 Supplement):21080. En este Anexo 3 se adjunta el resumen de la aportación al congreso y de la clasificación de la revista obtenida del Journal Citation Reports (2010 JCR Science Edition).

323

2010 JCR Science Edition

Rank in Category: JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY Journal Ranking For 2010, the journal JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY has an Impact Factor of 18.970. This table shows the ranking of this journal in its subject categories based on Impact Factor. Category Name

ONCOLOGY

Total Journals Journal Rank Quartile in Category in Category in Category

185

4

Q1

Category Box Plot For 2010, the journal JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY has an Impact Factor of 18.970. This is a box plot of the subject category or categories to which the journal has been assigned. It provides information about the distribution of journals based on Impact Factor values. It shows median, 25th and 75th percentiles, and the extreme values of the distribution.

Key

A - ONCOLOGY

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Anexos Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

ANEXO 4: APORTACIÓN

DE

TRABAJOS

PUBLICADOS

NO

REFERENTES AL TRABAJO DE LA TESIS Durante mi formación como personal investigador y el desarrollo de esta tesis, he participado en otros proyectos de nuestro grupo de investigación “Inmunología Tumoral” junto con personal del Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera (IFAPA) Centro “Venta del Llano”, de las cuales surgieron las publicaciones que se detallan a continuación. Publicaciones: Warleta F, Sánchez-Quesada C, Campos M, Allouche Y, Beltrán G and Gaforio JJ. Hydroxytyrosol protects against oxidative DNA damage in human breast cells. Nutrients. 2011;3:839-57. Warleta F, Campos M, Sánchez C y Gaforio JJ. Uso de la Electroforesis Unicelular Alcalina (Comet assay) para la identificación de componentes naturales de los alimentos con propiedades preventivas del daño oxidativo al ADN celular. Lifescienceslab 2011;Mayo-Junio:72-74 Allouche Y, Warleta F, Campos M, Sánchez-Quesada C, Uceda M, Beltrán G and Gaforio JJ. Antioxidant, antiproliferative, and pro-apoptotic capacities of pentacyclic triterpenes found in the skin of olives on MCF-7 human breast cancer cells and their effects on DNA damage. J Agric Food Chem. 2011;59:121-30. Warleta F, Campos M, Allouche Y, Sánchez-Quesada C, Ruiz-Mora J, Beltrán G and Gaforio JJ. Squalene protects against oxidative DNA damage in MCF10A human mammary epithelial cells but not in MCF7

329

Anexos Utilidad pronóstica de la detección de CTCs en pacientes con tumores sólidos de origen epitelial.

and MDA-MB-231 human breast cancer cells. Food Chem Toxicol. 2010;48:1092-100. De estas publicaciones, dos de ellas ocupan posiciones relevantes según el Journal Citation Reports (2010 JCR Science Edition): •

Journal of Agricultural and Food Chemistry. -

Índice de impacto = 2,816

-

Categoría

a

la

que

pertenece:

Agricultura

Multidisciplinar



-

Cuartil que ocupa: primer cuartil.

-

Rango en la categoría (2010): 2/55.

Food and Chemical Toxicology. -

Índice de impacto de la revista = 2,602

-

Categoría a la que pertenece: Ciencia y Tecnología de los Alimentos

-

Cuartil que ocupa: primer cuartil

-

Rango en la categoría (2010): 16/128.

Cabe destacar que la publicación “Squalene protects against oxidative DNA damage in MCF10A human mammary epithelial cells but not in MCF7 and MDA-MB-231 human breast cancer cells”, fue catalogada por Thomson Reuters como “Fast Breaking Paper”(1) en Junio de

2011,

en

el

campo

de

las

Ciencias

Agrícolas

(http://sciencewatch.com/dr/fbp/2011/11junfbp/). En este Anexo 4 se adjuntan las cuatro publicaciones referidas anteriormente y el resumen de la clasificación de las revistas, en las que están

publicadas,

obtenidas

del

Journal

Citation

Reports

(2010 JCR Science Edition). (1)

330

Fast Breaking Papers: Artículos con mayor incremento porcentual en citaciones en sus respectivas áreas de conocimiento según el Essential Science IndicatorsSM del Thomson Reuters. Representan el 1% de los principales trabajos en cada área de conocimiento por año.

Nutrients 2011, 3, 839-857; doi:10.3390/nu3100839 OPEN ACCESS

nutrients ISSN 2072-6643 www.mdpi.com/journal/nutrients Article

Hydroxytyrosol Protects against Oxidative DNA Damage in Human Breast Cells Fernando Warleta 1,2, Cristina Sánchez Quesada 1,2, María Campos 1,2, Yosra Allouche 1,2,3, Gabriel Beltrán 2,3 and José J. Gaforio 1,2,* 1

2 3

Immunology Division, Department of Health Sciences, Faculty of Experimental Sciences, University of Jaén, Campus las Lagunillas s/n, 23071 Jaén, Spain; E-Mails: [email protected] (F.W.); [email protected] (C.S.Q.); [email protected] (M.C.); [email protected] (Y.A.) Agrifood Campus of International Excellence, ceiA3, Spain Instituto Andaluz de Investigación y Formación Agraria, Pesquera y de la Producción Ecológica (IFAPA), Centro “Venta del Llano”, 23620 Mengibar, Spain; E-Mail: [email protected]

* Author to whom correspondence should be addressed; E-Mail: [email protected]; Tel.: +34-953212002; Fax: +34-953211851. Received: 27 July 2011; in revised form: 8 September 2011 / Accepted: 14 September 2011 / Published: 13 October 2011

Abstract: Over recent years, several studies have related olive oil ingestion to a low incidence of several diseases, including breast cancer. Hydroxytyrosol and tyrosol are two of the major phenols present in virgin olive oils. Despite the fact that they have been linked to cancer prevention, there is no evidence that clarifies their effect in human breast tumor and non-tumor cells. In the present work, we present hydroxytyrosol and tyrosol’s effects in human breast cell lines. Our results show that hydroxytyrosol acts as a more efficient free radical scavenger than tyrosol, but both fail to affect cell proliferation rates, cell cycle profile or cell apoptosis in human mammary epithelial cells (MCF10A) or breast cancer cells (MDA-MB-231 and MCF7). We found that hydroxytyrosol decreases the intracellular reactive oxygen species (ROS) level in MCF10A cells but not in MCF7 or MDA-MB-231 cells while very high amounts of tyrosol is needed to decrease the ROS level in MCF10A cells. Interestingly, hydroxytyrosol prevents oxidative DNA damage in the three breast cell lines. Therefore, our data suggest that simple phenol hydroxytyrosol could contribute to a lower incidence of breast cancer in populations that consume virgin

Nutrients 2011, 3

840

olive oil due to its antioxidant activity and its protection against oxidative DNA damage in mammary cells. Keywords: breast cancer; Mediterranean diet; olive oil minor compounds; hydroxytyrosol; tyrosol; phenols; oxidative stress; reactive oxygen species; DNA damage

1. Introduction Olive oil is the major source of fats in the Mediterranean diet and is considered to be responsible for the health benefits associated with this diet. In fact, it has been demonstrated that people who consume virgin olive oil (VOO) present a lower incidence of several cancers, including breast cancer [1]. This effect has previously been attributed to the high content of monounsaturated fatty acids. However, more recently, the importance of the minor constituents of olive oil has been considered [2]. Over the last five decades, several publications have firmly established that ingestion of small quantities of certain compounds isolated from plants can lower the risk of cancer in mammals exposed to carcinogens, including polyphenols [3]. VOO contains relatively high amounts of minor compounds compared to other oils (refined olive oil or seed oils). Among these, phenolic compounds are present at levels between 200 and 1500 mg/kg [4] depending on the olive tree variety, climatic and agronomic conditions, degree of maturation at harvest, and the manufacturing process [4]. At present, there are many studies reporting biological activities in vitro, in vivo and in clinical assays of phenolic compounds naturally present in VOO. Between them, anti-inflammatory, cardioprotective antioxidant and chemopreventive effects in breast and other types of cancers have been defined [5]. The major phenols identified in olive oils include the simple phenols hydroxytyrosol (HT) and tyrosol (TY), secoiridoids and lignans [2]. The concentration of TY is always higher than of HT [6]. Hydrolysis of secoiridoid during olive oil storage results in the formation of HT and TY [7]. It has been well established that HT is a potent antioxidant because of its marked antioxidant activity, its ability to scavenge oxygen and nitrogen free radicals, to inhibit Low Density Lipoprotein (LDL) oxidation, platelet aggregation and endothelial cell activation and its protection against DNA damage [2,8]. HT was able to reduce the synthesis of prostaglandin E2 blocking the transcription of COX-2 and 5-lipooxygenase, thereby reducing the chronic influence associated with diseases such as cancer [9]. TY has been described as exerting a weak antioxidant activity, although it is able to scavenge peroxynitrite and superoxide radicals, inhibit LDL oxidation in Caco2 cells and inhibit LPS-induced cytokines release from human monocytes [10,11]. It has been suggested that HT and TY compounds might have preventive activity against breast cancer, but, at present, the exact role played by these phenols in breast cancer prevention is still unknown. In this sense, despite epidemiological evidence, in vitro experiments have not been conducted to check if there are different effects of the simple phenols HT and TY between human breast cancer cells and human breast non-cancer cells. The present study attempts to provide new insights into the antioxidant capacity of HT and TY and the in vitro effects on proliferation, cell cycle progression, apoptosis, reactive oxygen species (ROS)

Nutrients 2011, 3

841

production and oxidative DNA damage in the human breast epithelial MCF10A cell line and the human breast MCF7 and MDA-MB-231 cancer cell lines. 2. Experimental Section 2.1. Chemicals and Materials The following were purchased from Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, USA): Hepes Buffer; Sodium Pyruvate; Non-Essential Amino Acids mixture 100× (NEAA); 2ƍ,7ƍ-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA); Dimethyl sulfoxide (DMSO); 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2Htetrazolium-5-carboxanilide inner salt (XTT sodium salt) purity •90%; N-Methylphenazonium methyl sulfate (PMS) purity ~98%; 2-hydroxyphenyl ethanol (Tyrosol, CAS 501-94-0 (TY)) purity 98%; DL-all-rac-Į-Tocopherol (Vitamin E, CAS 10191-41-0 (TOC)) purity •96%; 6-Hydroxy-2,5,7,8tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox™ CAS 53188-07-1 (TR)) purity •97%; 2,2ƍ-Azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH) purity ~97%; 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) purity ~90%, (S)-(+)-camptothecin (CAS 7689-03-4 (CPT)) purity ~95%; 2,2ƍ-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) diammonium salt tablets (CAS 30931-67-0 (ABTS)); PBS; HBSS. 2-(3,4-dihydroxyphenyl) ethanol (Hydroxytyrosol, CAS 10597-60-1 (HY)) purity •98% was obtained from Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA). Minimum essential medium with Eagle’s salts (MEM), Fetal Bovine Serum (FBS) and Phenol-Red-free Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) were obtained from PAA Laboratories GmbH (Pasching, Austria). TrypLE Express, HuMEC Ready Medium kit and Fluorescein (FL) were obtained from Invitrogen (Eugene, OR, USA). K2S2O8 (CAS 7727-21-1) was obtained from Panreac Quimica S.A.U. (Barcelona, Spain). Culture plates were obtained from NUNC™ (Roskilde, Denmark). The PI/RNase Staining Buffer kit, FITC-conjugated Annexin V and Binding Buffer were obtained from BD Biosciences Pharmigen (San Diego, CA, USA). The Comet assay kit was obtained from Trevigen, Inc. (Helgerman CT, Gaithersburg, MD, USA). 2.2. DPPH Assay The antioxidant activity of HT and TY against the stable radical DPPH was measured as previously reported [12] with some modifications. Briefly, 100 μM ethanolic solution of DPPH was mixed with different ethanolic solutions of HT or TY in 96-well plates at 0.06, 0.13, 0.25, 0.5 and 1 (moles of antioxidant/moles of DPPH). (±)-Į-tocopherol (TOC) was used as a positive control and a sample without antioxidant was also measured as a blank control. The decrease in absorbance at 520 nm was determined immediately and every 5 min for 2 h in a microplate reader (TECAN, GENios Plus). Measurements were performed in triplicate. The inhibition of the DPPH radical was calculated according to the following percentage of Radical Scavenging Activity (% RSA) formula: % RSA = [(AC(0) í AA(t))/AC(0)] × 100 where AC(0) is the absorbance of the control at t = 0 min and AA(t) is the absorbance of the antioxidant at t = 50 min.

Nutrients 2011, 3

842

2.3. ABTS Assay ABTS cation radical scavenging activity was determined using a previously reported procedure [13]. ABTS radicals (ABTS•+) were obtained by ABTS/H2O 0.5 mM reaction with K2S2O8 for 16 h in the dark at room temperature. ABTS•+ was diluted in ultrapure water until absorbance at 734 nm was 0.7 (±0.1). HT, TY and Trolox™ (TR) (as antioxidant reference) was dissolved in ethanol to yield a 10 mM stock solution and diluted with ultrapure water to the assayed concentrations. Twenty microliters of each concentration of HT, TY, standard (TR), blank (ultrapure water) or ethanol control (8%) were added to a 96-well plate. The reaction was initiated by the addition of 280 μL of ABTS•+. Absorbance readings were taken every 5 min at 30 °C for 2 h in a microplate reader (TECAN, GENios Plus). All determinations were carried out in triplicate. The inhibition of ABTS•+ was calculated according to the percentage of Radical Scavenging Activity (% RSA) described above (at t = 30 min). 2.4. ORAC Assay Peroxyl radical scavenging activity was measured by the ORACFL assay as previously described [14]. A stock solution of HT or TY were reconstituted in DMSO and then diluted in PBS. A stock solution of TR, as antioxidant standard, was also diluted in DMSO and diluted in PBS. The assay was carried out in 96-well plates with a final volume of 160 ȝL. Samples were run in triplicate. Fluorescein (48 nM) was mixed with various concentrations of SQ, standard (TR) or blank (PBS) containing at final volume 1% (v/v) DMSO. Plates were incubated for 15 min at 37 °C. The assay was initiated by the addition of AAPH (100 mM) and fluorescence readings (Ex: Ȝ485/Em: Ȝ520 nm) were taken every 5 min at 37 °C for 160 min in a microplate reader (TECAN GENios Plus). Final results were calculated based on the difference in the Area Under the fluorescence decay Curve (AUC) between the blank and each sample. The AUC formula was: AUC = 1 + f1/f0 + f2/f0 + f3/f0 + f4/f0 + … + f20/f0 Results were expressed as micromolar TR equivalents (TE) calculated using the line equation from the standard curve: TE = (Y í b)/m where Y is the net AUC (AUCsample í AUCcontrol), m is the slope and b is the Y-intercept. 2.5. Cell Culture Highly invasive MDA-MB-231 human breast cancer cells (estrogen and progesterone receptor-negative), minimally invasive MCF7 human breast cancer cells (estrogen and progesterone receptor-positive) and immortalized non-tumorigenic MCF10A human breast epithelial cells, were obtained from American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). Breast tumor cells were grown as a monolayer culture in Minimum Essential Medium with Eagle’s salts (MEM) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1% Hepes Buffer 1 M, 1% Sodium Pyruvate 100 mM and 1% Non-Essential Amino Acids mixture 100×. MCF10A cells were cultivated in HuMEC Ready Medium. All cell lines were maintained at 37 °C in a humidified incubator with 5% CO2. Cells were

Nutrients 2011, 3

843

routinely sub-cultured using TrypLE Express solution. Cells in the exponential growth phase were used for all experiments. 2.6. Cell Proliferation Assay Cell proliferation, measured as the cellular growth of treated cells vs. untreated controls, was measured using an XTT-based assay as described by Scudiero et al. [15] with some modifications. Briefly, cells were seeded at 2 × 103 cells/well (MCF7) or 1 × 103 cells/well (MDA-MB-231 and MCF10A) into 96-well culture plates (flat bottom) (100 ȝL of cell suspension/well). At 24 h after plating, 100 ȝL of fresh culture medium, with different concentrations of HT or TY was added in triplicate to the wells. Plates were incubated for 24 h or 24 h followed by a 48 h proliferation period with fresh medium at 37 °C and 5% CO2. At these time points, medium was removed and 200 ȝL of fresh RPMI medium without phenol red that contained XTT (200 ȝg/mL) and PMS (20 ȝg/mL) was added. Plates were incubated for 3 h at 37 °C in 5% CO2 and absorbance was measured at 450 nm wavelength (620 nm as reference) in a plate reader (TECAN GENios Plus). Viability was calculated using the formula: viable cells (%) = (ODtreated cells/ODcontrol) × 100 where OD is the difference in absorbance between optical density units (OD = OD450 í OD620). All measurements were performed in triplicate and each experiment was repeated at least three times. 2.7. Cell Cycle Assay Cells were seeded in 12-well culture plates at 1 × 105 cells/well for MCF7 and MDA-MB-231 or at 5 × 104 cells/well for MCF10A for 48 h. Cells were then treated with different doses of HT or TY for 24 h. After incubation, cells were washed in cold PBS, fixed with cold 70% ethanol and stored at í20 °C for at least 24 h. At least 1 × 104 cells per sample were analyzed on an EPICS XL-MCL (Beckman Coulter, Spain) flow cytometer after propidium iodide labeling (PI/RNase Staining Buffer kit). The percentage of cells in G0/G1, S and G2/M phases were calculated using FlowJo program (v5.7.2). Each experiment was repeated three independent times. 2.8. Apoptosis The percentage of apoptosis was determined using a double staining assay with FITC-conjugated Annexin V and propidium iodide (PI). Briefly, after 24 h of cell exposure to the previously indicated doses of HT or TY in 12-well culture plates, cells were harvested, washed twice in cold PBS and resuspended in 100 ȝL 1× Annexin Binding Buffer. Cells were then stained with 5 ȝL Annexin V-FITC and 1 ȝL PI solution, gently vortexed, and incubated for 15 min at room temperature in the dark before flow cytometric analysis. As a positive control, cells were treated with 1 ȝM camptothecin (CPT). Each experiment was repeated three independent times.

Nutrients 2011, 3

844

2.9. Reactive Oxygen Species Detection Intracellular reactive oxygen species (ROS) level was measured using a cell-permeable fluorescent probe, 2ƍ,7ƍ-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) as we described previously [16]. In brief, cells were seeded into 96-well culture plates at 1 × 104 cells/well (MCF7, MDA-MB-231 cells) or 5.5 × 103 cells/well (MCF-10A cells). After 24 h at 37 °C and 5% CO2, cells were treated with different doses of HT or TY for 24 h. Cells were then washed twice with Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) and incubated with fresh DCFH-DA (100 ȝM) in HBSS for 30 min at 37 °C in 5% CO2. DCFH-DA stock solution (20.5 mM) was prepared in DMSO and stored at í20 °C for maximum one month. After that, cells were washed twice in HBSS, and wells were filled with 100 μL HBSS before fluorescence acquisition in a plate reader (TECAN GENios Plus) (Ex: Ȝ485/Em: Ȝ535 nm, Gain 60). Intracellular ROS level percentage was calculated as follows: F = [(Ft30 í Ft0)/Ft0] × 100 where Ft0 is the fluorescence at t = 0 min and Ft30 the fluorescence at t = 30 min. It has been reported that the addition of H2O2 increases oxidative stress in cultured cells [17]. Therefore, in order to evaluate the protective capacity of HT or TY against induced oxidative stress, H2O2 (500 ȝM) was added to the wells after removal of assay medium. This allows avoiding a direct reaction in the medium between these compounds and the oxidant source. After 30 min at 37 °C, fluorescence was quantified as described above. All tests were run in triplicate for each experimental condition and each experiment was repeated at least three times. All experiments were conducted using iron-free media (MEM and HuMEC). 2.10. Alkaline Single-Cell Gel Electrophoresis (Comet Assay) At 24 h, cells treated with HT or TY were scraped into 12-well culture plates, washed twice (300× g 10 min, 4 °C) with cold 1× PBS (Ca2+/Mg2+ free) and resuspended in 1 mL of cold 1× PBS. In order to evaluate the ability of HT and TY to prevent oxidative DNA damage, cell suspensions were exposed for 10 min to 50 μM H2O2 at 4 °C. After that, cells were washed twice and frozen in FBS-DMSO (90:10, v/v) at í80 °C until the Comet assay procedure. DNA single strand break by alkaline microgel electrophoresis was performed according to Singh et al. [18] with some modifications. Cells were thawed in a bath at 37 °C, centrifuged (300× g 10 min, 4 °C) in cold MEM with 25% FBS and resuspended in cold 1× PBS to a density of 1.65 × 105 cells/mL. Cells were then suspended in melted and cooled (at 40 °C) low melting point agarose (LMA). Cell suspensions (50 μL) were spread over a sample area of pre-warmed 1% normal melting point agarose (NMA) precoated CometSlide™ slides. After 15 min at 4 °C in the dark, slides were immersed in cold Lysis Solution (Trevigen, Inc.) at 4 °C for 30 min to dissolve lipids and proteins. In order to separate the two DNA strands, slides were then immersed in fresh Alkaline Solution (pH > 13) for 30 min at room temperature in the dark. Electrophoresis was performed in an Ebony acrylic electrophoresis tank with a cooled platform containing cold Alkaline Electrophoresis Solution (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH > 13) at 25V (1 V/cm) and 300 mA for 40 min. The slides were washed twice with distilled water for 10 min and neutralized with 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 for 5 min,

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followed by immersion in 70% ethanol for 5 min and air-dried overnight at room temperature. Slides were stained with Sybr® green before scoring. 2.11. Slide Scoring and Analysis DNA strand breaks were examined using a fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200) equipped with a Luca EMCCD camera (Andor Technology, Belfast, UK) under 494 nm excitation and 521 nm emission wavelength using the Komet 5.5 software package (Kinetic Imaging Ltd., Liverpool, UK). Fifty cell images were randomly characterized per sample using 20× magnification. Relative fluorescence between head and tail through the olive tail moment (Olive_TM) was used to determine DNA damage. Olive_TM is defined as the product of the Tail Moment Length and the fraction of DNA in the tail. Olive_TM = [(Tail (mean) í Head (mean)) × Tail (% DNA)]/100 2.12. Statistical Analysis Results are presented as mean (±SEM), except for cell proliferation results. For this assay, results are presented as mean (±SD). Results are expressed as a percentage relative to the control, which was defined as 100%. Statistical analysis was performed using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Fisher’s least significant difference (LSD) test. Values of p < 0.05 were considered significant. Statgraphics Plus 5.1 statistical software (Statpoint Technologies, Inc., Warrenton, VA, USA) was used for the statistical analysis. 3. Results 3.1. Effect of HT and TY on Radical Scavenging Activity Radical scavenging capacity was determined using DPPH, ABTS and ORAC assays. The antiradical activity of HT and TY, measured by scavenging activity in the DPPH radical assay, indicated that HT at up to 10 mole ratio (mole antioxidant/mole DPPH) exerts a slightly higher scavenging activity than TOC while TY does not possess a radical scavenger activity (Table 1(a)). The ABTS antiradical assay showed that HT was more effective than TR in scavenging the ABTS cationic radical while TY exhibited a maximum 85% RSA at 800 μM (Table 1(b)). The peroxyl radical scavenging activity of HT and TY, measured by the ORACFL assay, showed a protective effect against AAPH-induced peroxyl radical activity for both phenols. Both exerted higher protection against the peroxyl radical than TR for low concentrations up to 100 μM (Table 1(c)). 3.2. Cell Proliferation To investigate the effect of HT and TY on human breast cell growth, cells were treated with concentrations of HT or TY ranging from 1 to 100 ȝM for 24 h. Neither HT nor TY had significant effects on the cell proliferation rates of MCF7, MDA-MB-231 and MCF10A cells (Figure 1(a)), even after an additional 48 h with fresh medium (Figure 1(b)). We also investigated the potential antiproliferative effect of these compounds at high, non-physiological concentrations up to 1000 or

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5000 ȝM of HT or TY, respectively. HT showed a dose-dependent reduction of cell proliferation in the three cell lines from a concentration of 200 ȝM with an absence of viability observed at 1000 ȝM, while TY did not affect cell viability at any concentration assayed (data not shown). No marked changes in cell morphology were observed by light microscopy in any of the cell lines tested when concentrations between 1 and 100 ȝM of HT or TY were used (data not shown). Table 1. Antioxidant activity of hydroxytyrosol (HT) or tyrosol (TY) quantified as Radical Scavenging Activity (RSA) by (a) DPPH assay (% RSA at 50 min) and (b) ABTS assay (% RSA at 30 min); (c) Antioxidant activity quantified as Trolox Equivalent (TE) by ORACFL assay. Trolox™ (TR) and Į-tocopherol (TOC) were used as antioxidant references. (a) mole AH/ mole DPPH 0 0.06 0.13 0.25 0.5 1 2.5 5 10

HT

TY

TOC

3.96 36.24 71.47 96.40 97.80 98.07 n.d. n.d. n.d.

3.64 n.d. 5.20 4.25 3.02 2.59 2.34 3.44 3.37

3.63 23.21 48.16 75.85 90.17 95.98 n.d. n.d. n.d.

n.d.: not determined.

(b) μM 6 12.5 25 50 100 200 400 800

HT 5.07 5.45 8.42 18.09 36.63 69.53 96.30 99.47

TY 10.31 14.32 20.14 31.81 44.55 58.25 73.82 85.04

TR n.d. n.d. n.d. 16.21 29.39 50.07 88.03 99.48

n.d.: not determined.

(c) TE (μM) 3.12 6.25 12.5 25 50 100

HT (μM) 14.82 30.97 50.37 92.24 150.43 262.76

TY (μM) 1.64 8.30 20.84 58.35 106.76 205.57

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Figure 1. Cell proliferation assay measured with XTT tetrazolium salt (a) after 24 h of HT or TY exposure, or (b) after 24 h of HT or TY exposure followed by 48 h with fresh medium. Data are the mean (±SD) relative to an untreated control of three independent assays carried out in triplicate. (a)

(b)

3.3. Cell Cycle and Apoptosis To evaluate whether HT or TY interfered with the cell cycle or the induction of apoptosis, MCF7, MDA-MB-231 and MCF10A cells were treated for 24 h with increasing concentrations of HT or TY (between 10 and 200 ȝM). The results revealed that HT and TY did not alter the cell cycle in any of the cell lines studied (data not shown). Flow cytometric analysis of apoptosis revealed that treatment with HT or TY for 24 h did not induce apoptosis in MCF10A cells or in MCF7 or MDA-MB-231 cells when compared to the controls (data not shown). 3.4. Intracellular ROS Level Intracellular reactive oxygen species (ROS) were quantified by the dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) assay using a microplate reader. Results showed a dose-dependent decrease in ROS level of MCF10A cells treated for 24 h with either HT or TY. However, HT and TY failed to significantly decrease intracellular ROS level in either MCF7 or MDA-MB-231 cells (Figure 2(a)). While HT

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reduced ROS level by up to 20% in MCF7 cells, this reduction was not considered statistically significant (p = 0.34). H2O2 effectively induced oxidative stress in both, human breast cancer cells and human breast epithelial cells (Figure 2(b)). In order to investigate the in vitro preventive effect of HT or TY against H2O2-mediated oxidative stress, we measured the intracellular ROS level in cells treated with HT or TY for 24 h. As can be seen in Figure 2(c), MCF10A cells treated with HT or TY showed a significant dose-dependent decrease in ROS production compared to the control. In addition, HT was also able to decrease the ROS level in MCF7 and MDA-MB-231 cells induced by H2O2 exposure. It is worth mentioning that the decrease in ROS level was greater in the breast epithelial cell line than in the breast cancer cell lines. On the other hand, TY did not decrease ROS level in MCF7 or MDA-MB-231 cells at concentrations up to 5000 ȝM (Figure 2(c)). Figure 2. (a) Intracellular reactive oxygen species (ROS) in breast cells treated for 24 h with HT or TY; (b) Increase of the cellular ROS level after an oxidative burn with H2O2; (c) Intracellular ROS in breast cells treated for 24 h with HT or TY followed by an oxidative burst with H2O2. Inhibitory effects of HT and TY are shown as percent inhibition of untreated or H2O2-stimulated fluorescence and represented as the mean ± SEM of three independent replicates carried out in triplicate. † MCF7; ‡ MDA-MB-231; * MCF10A indicates significant differences. (a)

*

* *

*

*

*

* *

*

(b)

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*

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849 Figure 2. Cont.

(c)

† ‡

† ‡

† ‡

† ‡

† ‡

* * *

*

* *

* *

*

* *

IC20 and IC50 values were defined as the values for 20% and 50% antioxidant inhibition of basal or H2O2-stimulated fluorescence in DCFH-DA probes. The Relative Antioxidant Value (RAV) ratio was found to be a good parameter for the determination of oxidative inhibition profiles. RAV= [(IC20 (PH)/IC20 (TOC)) + (IC50 (PH)/IC50 (TOC))]/2 where PH is the compound (simple phenol) and TOC is the reference (Į-tocopherol). Our results showed that TY has a RAV about 46-fold higher than TOC for MCF10A cells whereas HT only has 1.44-fold higher. This indicated much high antioxidant activity of HT compared with TY in normal breast cells, but less than TOC (Table 2). In MCF7 and MDA-MB-231 cells, a 50% antioxidant inhibition was not observed; therefore, RAV ratios were not determined in these cell lines. Interestingly, in H2O2-stimulated MCF10A cells, the RAV ratio of TY was 42-fold higher than TOC, indicating a very low antioxidant capacity in normal breast cells. The 0.67-fold difference between RAV ratio of HT and TOC is of particular interest, due to the high antioxidant activity of HT in H2O2-stimulated MCF10A cells (Table 2). Table 2. Oxidative inhibition in MCF10A cells. IC20 and IC50 values defined as the values for antioxidant inhibition of basal or H2O2-stimulated fluorescence in DCFH-DA assays and the Relative Antioxidant Value (RAV) as a parameter for the relative determination of oxidative inhibition profiles compared to Į-tocopherol.

IC20 IC50 RAV

HT (μM) 3.52 65.64 1.44

Basal TY (μM) 4.04 2942.60 46.60

TOC (μM) 4.33 31.89 1.00

HT (μM) 2.66 20.66 0.67

H2O2-stimulated TY (μM) TOC (μM) 65.36 2.49 4244.40 73.50 42.00 1.00

3.5. Effect of HT and TY on Oxidative DNA Damage The ability of H2O2 to induce DNA strand breaks in these human breast epithelial cell lines was examined using the Comet assay. In untreated cells, DNA does not migrate far from the origin when examined by alkaline microgel electrophoresis (Figure 3(a)). Following H2O2 exposure, control and

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pretreated breast cells with damaged DNA have the shape of a comet, the tail length and fluorescent intensity of which are related to the number of DNA strand breaks induced by the DNA-damaging agent (Figure 3(b,c)). Figure 3. Representative images of Comet assay analysis of MCF10A cells. (a) Untreated cell, showing a circular shape indicating absence of DNA damage; (b) 10 min. H2O2 exposed cell, exhibiting a long and bright tail related to DNA strand breaks, indicating DNA oxidative damage; (c) 10 min. H2O2 exposed cell after 24 h of 100 μM HT pretreatment, illustrating the reduction of tail length and fluorescent intensity indicative of reduced DNA damage. A

B

C

Breast cells exposed to H2O2 were effectively DNA damaged and the mean olive tail moment (Olive_TM) was determined by the Comet assay. Breast epithelial cells were the most sensitive to the H2O2-induced DNA damage (Figure 4(a)). In unexposed cells, HT reduced DNA damage significantly in MCF7, MDA-MB-231 and MCF10A cells whereas TY only reduced it in MCF10A cells (Figure 4(b)). In H2O2-exposed cells, HT showed a preventive DNA damage effect in the three cell lines whereas TY was unable to reduce Olive_TM in any of the cell lines; indeed, in MDA-MB-231 cells, TY increased Olive_TM significantly. Figure 4. Olive Tail Moment (Olive_TM) as the mean ± SEM for three independent assays. (a) After an H2O2 injury; (b) after 24 h of HT or TY treatment, and (c) after 24 h of HT or TY treatment followed by an H2O2 injury. (a)

*

* *

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851 Figure 4. Cont.

(b) )

(c)

4. Discussion There is some scientific evidence relating Mediterranean dietary pattern with a lower incidence of cardiovascular diseases and cancer, among other diseases. Virgin olive oils (VOOs) represent the main source of fats in this diet and it has been demonstrated that consumption of VOOs reduces human arterial hypertension, lipid peroxidation of membranes, tumor incidence and number of tumors [19,20]. Minor compounds play a key role in VOOs’ healthy properties. Among them, phenols have demonstrated healthy bioactivity properties. Interest in phenolic compounds has increased greatly, with attention being focused on finding naturally occurring antioxidants for foods or medical uses to replace synthetic antioxidants that, in some cases, have been reported to be carcinogenic [21]. HT and TY are two of the major simple phenols present in VOOs as simple form or conjugates [2]. Bioavailability studies have demonstrated that they are dose-dependently absorbed in animals and humans after olive oil ingestion [22], accumulated in the body and, finally, systemically exert biological effects [23]. The present work describes the antioxidant capacity of HT and TY molecules using chemical and cellular assays and their relationship with proliferation of human breast tumor vs. normal cells.

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HT and TY are structurally identical except that HT has an extra –OH group forming a catechol group, which is considered responsible for its higher antioxidant activity. This catechol group is able to stabilize free radicals through the formation of intermolecular hydrogen bonds [8]. In our chemical analysis, the catechol phenol HT exhibited a strong antioxidant activity in DPPH, ABTS and ORAC assays, while TY, without a catechol group, showed a weak antioxidant activity in DPPH assay. Remarkably, TY acts as an efficient scavenger against ABTS and AAPH radicals, although to a lesser extent than HT, indicating the minor importance of the cathecol group in cationic or peroxylic radicals’ scavenging activities. These results are in agreement with those previously reported by Visioli et al. [8] affirming that HT and, to a lesser degree, TY are more potent scavengers of free radicals than vitamin E. Although nowadays there is no scientific evidence relating to the physiological concentrations of HT or TY after olive oil ingestion, some authors have suggested it could be between 10 and 100 ȝM [24]. Cell treatment with HT or TY in the range of their possible physiological concentrations (1–100 ȝM) did not have any effect on cell proliferation in any of the cell lines studied, independently of the exposure times. However, HT dramatically reduced the viability of MCF7, MDA-MB-231 and MCF10A cell lines when used at concentrations from 200 ȝM to 1000 ȝM. Fabiani et al. described such an effect in colon adenocarcinoma HT29 cells [25]. Furthermore, HT and TY did not alter the cell cycle or induce apoptosis in these cell lines. Although these results are in agreement with those achieved in LLC-PK1 renal cells, they are in contrast with results in human promyelocytic leukaemia HL60 cells with a noticeable antiproliferative, cell cycle arrest and apoptotic effect of HT. Otherwise, TY showed no antiproliferative effect in HL60 cells [7,25]. HT or TY’s inability to inhibit breast cancer cell proliferation at the assayed times and concentrations, suggests that they cannot protect against breast cancer once developed. Quiles et al. [24] described the lack of inhibition of HT or TY in PC3 cells treated with 10 to 250 ȝM, as did Menendez et al. [26] in SKBR3 and MCF7 cells after 5 days of HT or TY treatments in the range of 6.25 to 100 ȝM. Moreover, Sirianni et al. [27] recently described the dose-dependent inhibition of MCF7 cell proliferation by HT and oleuropein (OL) with treatments of 1 to 100 ȝM; cell growth was induced by 17-ȕ-estradiol (E2). In addition, HT and OL are not able to interfere with estrogen action through competition with estrogen receptors (ER), which are responsible for activation of the gene expression involved in cell proliferation. In order to clarify how nutritional antioxidants are able to prevent or treat oxidative damage, Berger [28] affirmed that nutrients cannot treat an installed disease, such as gastrointestinal cancer, but that they may prevent its promotion. Indeed, the answer to the question: “Can installed damage caused by ROS be treated by antioxidant nutrients?” is “probably not”, but the answer to the question: “Can oxidative damage be treated nutritionally?” is “yes” [28]. Growing evidence supports the hypothesis that risk factors such as lifestyle, age, environment, diet, drinking, smoke, etc. are determinants in breast neoplastic transformation, and are closely associated with a chronic increase in the basal level of oxidative stress. A decrease in oxidative stress state could prevent the development of tumors and, potentially, cancer. In fact, serum markers for oxidative DNA damage have been shown to increase in women diagnosed with breast cancer [29]. On the other hand, it has been suggested that consumption of VOOs, which are particularly rich in phenolic antioxidants, such as HT and TY, should afford considerable protection against breast cancer by inhibiting oxidative

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stress [2]. In our study we demonstrated that HT and TY reduce basal and H2O2-induced ROS level in breast epithelial MCF10A cells, whereas TY failed to reduce both in MCF7 or MDA-MB-231 cells and HT only reduced H2O2-induced ROS level slightly in breast cancer cells. These results point to a differential antioxidant activity of both compounds between normal breast and tumor cells as we described for squalene [16]. Thus, we suggest that HT and TY could prevent oxidative stress in normal breast cells, thereby preventing the initiation of a chain of reactions to transform normal cells into cancer cells. Noticeably, it is necessary to use a much larger amount of TY to obtain the same ROS reduction level as HT in MCF10A cells (Table 2). Up to 100 ȝM concentrations of HT and TY used in the present study are probably within the physiological range. However, 500 to 5000 ȝM of TY exceed this range and could be regarded as being in the pharmacological range. Di Bendeto et al. [11] described differences between HT and TY in inhibiting cell-mediated oxidation of LDL (100% HT vs. 40% TY) in J774 A.1 macrophage cells due to its intracellular presence. Thus, time-dependent TY, accumulated inside the cell was effective only at later time-points (24 h) or at higher concentrations than HT, which was rapidly found inside the cells and disappeared within 18 h. Thus, we can presume a quick antioxidant defense by HT followed by a slower defense by TY upon VOO intake. Estrogens, known human breast pro-carcinogens, exert their actions by two mechanisms; the ER-dependent mechanism, involving the activation of ER and subsequent stimulation of cell growth and proliferation [30] or the ER-independent mechanism, involving the generation of genotoxic estrogen metabolites, which are highly reactive and damage DNA by the formation of free radicals and consequently ROS [30]. In accordance with Sirianni et al. [27], HT inhibition of E2-induced MCF7 proliferation does not involve the ER-dependent mechanism but points to an inhibition of the E2 signaling pathway. Felty et al. [31] identified mitochondria as a major source of E2-induced ROS (mtROS) in breast cancer cells and described mtROS as a messenger involved in signaling pathways of cell proliferation control, increasing the transcription of cell cycle genes. These authors found the same amount of mtROS in ER-negative MDA-MB-468 cells and in ER-positive MCF7 or T47D cells, suggesting that mtROS production does not depend on the presence of ER in breast cancer cells. If mtROS acts as a messenger in breast cancer proliferation, it could explain why an antioxidant such as HT reduces E2-induced cell proliferation, as described by Sirianni et al., whereas in the same concentrations without E2 stimulation we do not detect any significant growth alteration. Cellular protection against oxidative stress is provided by two types of antioxidants; direct antioxidants with a redox activity; and indirect antioxidants (redox active or not) which activated the Nrf2/ARE pathway resulting in transcription of phase II enzymes such as glutathione S-transferase, NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1 or glutathione reductase [32]. In addition to the fact that HT and TY act as direct antioxidants, they could also be indirect antioxidants activating the nuclear factor-like 2 (Nrf2). Nrf2, considered a key factor in the cellular defense mechanisms against oxidative stress, might be induced more strongly in MCF10A cells than in MCF7 and might have little or no effect in MDA-MB-231 cells, explaining the differential protection effect of HT and TY on intracellular ROS level. To the best of our knowledge, until now, only Liu et al. [33] have described the protection of HT on ARPE-19 human retinal pigment epithelial cell line from oxidative stress induced by acrolein, a major component of cigarette smoke. Further studies will be necessary to

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elucidate the possible Nrf2/ARE pathway intervention of HT and TY differential antioxidant activity in breast cell lines. HT has been described as preventing DNA damage beyond its antioxidant capacity, as it can affect a range of enzymes, including cyclooxygenase and NAD(P)H oxidase while TY has no protective effect [8]. In accordance with these authors, our findings point to a protective effect of HT against basal and H2O2-induced DNA damage regardless of the breast cellular type, whereas TY only has a protective effect on ROS basal level in non-tumoral breast cells. Both compounds reduce intracellular ROS level and oxidative DNA damage in normal breast cells. This could protect against cellular mutations, preventing carcinogenesis. However, when the disease has occurred, oxidative status in the malignancy place is altered. In this condition, while HT still protects non-tumor breast cells against DNA damage, TY fails to protect them at physiological concentrations. Although HT contributes to reduce DNA damage in normal breast cells, it protects breast tumor cells too. Accordingly, our results must be interpreted carefully, because a reduction of DNA damage in cancer cells might promote cell growth and might inhibit the action of anthracycline chemotherapeutic agents, such as doxorubicin, which induces apoptosis of cancer cells by the oxidative damage resulting from enhanced oxidative state of the cells or, in contrast, might reduce ROS messenger signaling of proliferation resulting in a reduction of tumor cell growth. In any case, we have not detected any modulation of the growth activity in vitro in breast cancer cells after HT or TY treatment at the assayed times. In this paper, HT has been described as an antioxidant compound with higher activity than TY and related to the prevention of breast cancer, but we must not forget that VOO´s minor compounds can interact with each other, potentiating or inhibiting the effects described for each component alone. Our results indicate some healthy properties of these two simple phenols which may be of interest in pharmacology or as a nutritional supplement or could even lead to establishing the ideal concentrations of each component in VOOs in order to label it as a healthy oil. However, we must be prudent about extrapolating these results regarding epidemiological olive oil health impacts. Future work is needed to investigate these synergetic or inhibitory effects. 5. Conclusions The simple phenol HT could contribute to the preventive cancer activity attributed to VOOs due to the reduction of oxidative stress and oxidative DNA protection in normal breast cells at physiological concentrations, whereas TY is needed at pharmacological concentrations to reduce oxidative stress and fails to protect DNA damage against an oxidative burst. Both phenols exert a selective antioxidant defense, preventing oxidation in normal breast cells but not in breast cancer cells, which could be helpful to cancer therapies that increase oxidative stress. HT also prevents induced DNA damage in cancer cells, so it might interfere with these therapies. Although in vitro studies have pointed to a preventive role of HT against human breast cancer, the precise mechanisms of action remain to be clarified. Further studies are necessary to elucidate the cellular signaling events that HT and TY target in oxidative stress protection and subsequent breast cancer prevention.

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Acknowledgments This study was supported by the “Instituto Andaluz de Biotecnología” (BIOÁNDALUS 08/22/L5.3); Ministerio de Ciencia e Innovación-FEDER (RTA2008-00066-C03-03); and “Centro de Excelencia en Investigación sobre Aceite de Oliva y Salud” (CEAS). Conflict of Interest The authors declare no conflict of interest. References 1.

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26. Menendez, J.A.; Vazquez-Martin, A.; Colomer, R.; Brunet, J.; Carrasco-Pancorbo, A.; Garcia-Villalba, R.; Fernandez-Gutierrez, A.; Segura-Carretero, A. Olive oil’s bitter principle reverses acquired autoresistance to trastuzumab (Herceptin™) in HER2-Overexpressing breast cancer cells. BMC Cancer 2007, 7, 80. 27. Sirianni, R.; Chimento, A.; de Luca, A.; Casaburi, I.; Rizza, P.; Onofrio, A.; Iacopetta, D.; Puoci, F.; Andò, S.; Maggiolini, M.; et al. Oleuropein and hydroxytyrosol inhibit MCF-7 breast cancer cell proliferation interfering with ERK1/2 activation. Mol. Nutr. Food Res. 2010, 54, 833–840. 28. Berger, M.M. Can oxidative damage be treated nutritionally? Clin. Nutr. 2005, 24, 172–183. 29. Musarrat, J.; Arezina-Wilson, J.; Wani, A.A. Prognostic and aetiological relevance of 8-hydroxyguanosine in human breast carcinogenesis. Eur. J. Cancer 1996, 32A, 1209–1214. 30. Yager, J.D.; Davidson, N.E. Estrogen carcinogenesis in breast cancer. N. Engl. J. Med. 2006, 354, 270–282. 31. Felty, Q.; Xiong, W.-C.; Sun, D.; Sarkar, S.; Singh, K.P.; Parkash, J.; Roy, D. Estrogen-induced mitochondrial reactive oxygen species as signal-transducing messengers. Biochemistry 2005, 44, 6900–6909. 32. Dinkova-Kostova, A.T.; Talalay, P. Direct and indirect antioxidant properties of inducers of cytoprotective proteins. Mol. Nutr. Food Res. 2008, 52, S128–S138. 33. Liu, Z.; Sun, L.; Zhu, L.; Jia, X.; Li, X.; Jia, H.; Wang, Y.; Weber, P.; Long, J.; Liu, J. Hydroxytyrosol protects retinal pigment epithelial cells from acrolein-induced oxidative stress and mitochondrial dysfunction. J. Neurochem. 2007, 103, 2690–2700. © 2011 by the authors; licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution license (http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/).

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Uso de la Electroforesis Unicelular Alcalina (Comet assay) para la identificación de componentes naturales de los alimentos con propiedades preventivas del daño oxidativo al ADN celular sss.UESTROGRUPODEINVESTIGACIØNh)NMUNOBIOLOGÓA4UMORALvESGRUPOCATALOGADOENEL0LAN!NDALUZDE)NVESTIGACIØNCØDIGO#43  YADSCRITOAL )NSTITUTO!NDALUZDE"IOTECNOLOGÓA)!" ØRGANOEXPERTOEN"IOTECNOLOGÓA DENTRODELA#ONSEJERÓADE%CONOMÓA )NNOVACIØNY#IENCIADELA*UNTA DE!NDALUCÓA YCUYOPRINCIPALOBJETIVOESIMPULSARYPOTENCIARELSECTOR BIOTECNOLØGICOANDALUZFAVORECIENDOLOSVÓNCULOSENTREGRUPOSDEINVESTIGACIØNYTEJIDOEMPRESARIAL

Fernando Warleta, María Campos, Cristina Sánchez, José Juan Gaforio, Área de Inmunología, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad de Jaén

Introducción: La idea de la electroforesis celular en microgel se introdujo por Ostling y Johanson en 1984 para ver la rotura de cadena doble de ADN por radiación ultravioleta. Como la imagen obtenida se asemejaba a un cometa con una cabeza de ADN sin dañar y una cola con fragmentos de ADN, se le dio el nombre de “Comet assay”, por el que es más conocida esta técnica. En 1988, Singh y cols. modificaron la técnica sometiéndola a condiciones muy alcalinas (pH>13) para ver 72

MAYO/JUNIO11

niveles muy bajos de rotura de cadena simple y lo combinaron con una marcación fluorescente para su recuento por microscopía de fluorescencia. Años más tarde, en 1990, una nueva modificación introducida por Olive y cols., consistente en suavizar las condiciones alcalinas, nos permitió detectar niveles normales de rotura de cadena simple como los producidos por la exposición de las células a radiación o a determinados productos químicos. Estos autores desarrollaron también unas herramientas para la cuantificación de los resultados mediante la relación del contenido de ADN entre la cabeza; con ADN de alto peso molecular, y la cola; con los principales fragmentos migrados,

Los radicales libres están presentes en cualquier célula aeróbica, bien originados por la propia respiración, bien por su producción por otras fuentes como las infecciones, el humo del tabaco, la radiación ultravioleta, la contaminación ambiental, el deporte extremo, el consumo de determinados alimentos ricos en grasas trans o hidrogenadas, por determinadas enfermedades etc. Este exceso de radicales libres es controlado mediante sistemas enzimáticos como la Superóxido Dismutasa (SOD), la Catalasa (CAT) o la Glutation Peroxidasa (GPx), o no enzimáticos como el ácido ascórbico (vitamina C), alfa-tocoferol (vitamina E), glutatión (GSH), beta-caroteno, vitamina A, flavonoides y ácidos

fenólicos, así como por otros antioxidantes naturales ingeridos con la dieta. Estos sistemas son los encargados de mantener el equilibrio oxidativo intracelular evitando las consecuencias adversas que un desequilibrio oxidativo puede producir. Una elevada concentración de radicales libres en una célula, ataca a las moléculas estables para robarles un electrón, lo que las desestabiliza. Esto genera daños tanto en los lípidos de las membranas celulares (peroxidación lipídica), como en las proteínas (oxidación y nitración) y en los ácidos nucleicos (rotura de cadena simple). El ADN dañado por los radicales libres puede ser o bien reparado, o bien puede contener daños irreparables incompatibles con la supervivencia de la célula, por lo que esta moriría. Pero una tercera opción, y la más dramática, consiste en que esas roturas sean reparadas erróneamente causando mutaciones celulares que en última instancia sean precursoras de un cáncer. Fundamento: El fundamento del “Comet Assay” consiste en que el ADN desnaturalizado de una célula, &!2-%30!»!).$5342)!,

Fig. 1: Imágenes representativas del daño oxidativo al ADN analizas mediante el Comet Assay. (A) Células de epitelio mamario humano (MCF10A) sin daño al ADN. (B-E) MCF10A expuesta a concentraciones crecientes de H2O2 mostrando un incremento del daño oxidativo al ADN. Las células se marcaron con Sybr Green y se analizaron con un microscopio invertido de fluorescencia Zeiss Axiovert 200 con cámara EM-CCD Andor Luca y el software Komet 5.5.

Fig. 2: Imagen del daño al ADN sufrido por una célula en el que se distingue la cabeza con el ADN no dañado y una cola con fragmentos de ADN.

Un ADN muy dañado tendrá fragmentos cortos que migrarán más molécula con carga negativa, migrará hacia el ánodo al someterlo a un campo eléctrico en un gel de agarosa. La migración dependerá del tamaño del fragmento de ADN, de este modo, un ADN muy dañado tendrá fragmentos cortos que migrarán más que aquel ADN menos dañado, y aquella molécula de ADN sin roturas, no migrará permaneciendo en el núcleo. &!2-%30!»!).$5342)!,

La imagen de una electroforesis unicelular alcalina se asemeja a un cometa, de donde recoge su nombre más coloquial (Comet assay), en el que se distingue una cabeza que corresponde al núcleo con el ADN íntegro, y una cola formada por el ADN dañado en el que se puede apreciar una degradación del ADN según el tamaño de sus fragmentos (desde el más integro cercano a la cabeza, hasta el más dañado, alejado de la cabeza). Este ensayo puede ser aplicado en células procedentes de líneas celulares establecidas y cultivadas in vitro como, en muestras de sangre ex vivo o en modelos in vivo, así como en moluscos, peces, aves, etc. para el control y seguimiento de

tóxicos medioambientales, y debido a que es una técnica muy poco invasiva (tan sólo se requiere una extracción de sangre) se pueden realizar ensayos en humanos de forma muy sencilla. La diferencia entre la cantidad de ADN de la cabeza y de la cola nos dará un índice del daño oxidativo sufrido por esa célula, y nos permitirá cuantificar la potencial capacidad preventiva del daño oxidativo al ADN de los compuestos estudiados. La técnica la podemos resumir en los siguientes pasos: Partimos de una suspensión celular obtenida de nuestro ensayo (cultivos celulares, muestras de sangre, tejidos disgregados, etc.). Las células se suspenden en un gel de agarosa de bajo punto de fusión (low-melting point) y se depositan sobre un portaobjetos pre-cubierto con una lámina de agarosa (normalmelting point). Se lisan las células y se eliminan las proteínas celulares dejando al ADN celular libre en la agarosa. Sometemos a los portas a condiciones alcalinas con lo que desnaturalizamos el ADN separando las dos hebras. Las roturas previas de las cadenas simples producidas por los radicales libres dejarán separados desde este momento fragmentos de ADN de diferente longitud, siendo la cantidad de

fragmentos y su tamaño proporcional al daño al ADN sufrido por la célula. Se realiza una electroforesis bajo unas condiciones específicas: En un medio alcalino, con un voltaje bajo y un amperaje constante (25 V y 300 mA) durante unos 30 minutos. La electroforesis debe realizarse en oscuridad y el medio de electroforesis ha de permanecer frío durante todo el proceso ya que la luz y el calor podrían dañar el ADN apareciendo falsos positivos. Los ácidos nucleicos migrarán hacia el polo positivo (ánodo) de acuerdo al tamaño de los fragmentos. Los geles se neutralizan para su posterior marcación y, se deshidratan y fijan con etanol. El exceso de humedad puede eliminarse manteniéndolas en una estufa a 37 ºC previamente a su marcación. Para su marcación fluorescente podemos utilizar cualquier fluoroforo intercalante en el ADN como el Bromuro de Etidio, Sybr Green, Hoescht 33258, Ioduro de Propidio, DAPI, etc., aunque si no disponemos de un microscopio fluorescente podemos marcarlo con nitrato de plata para su observación colorimétrica mediante un microscopio óptico. La marcación colorimétrica presenta la desventaja de que tan sólo nos permitirá un recuento cualitativo, asignando un valor entre el 0 y el 4 según el daño observado, y no podremos aplicar las fórmulas más empleadas en la inMARZO/ABRIL11

73

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OTM = [Media(Cola) – Media(Cabeza)] x [% ADN(Cola)] / 100 OTM nos permite medir tanto los fragmentos pequeños de ADN que han migrado mucho pero tienen poca fluorescencia y los grandes que casi no han migrado pero tienen mucha fluorescencia. Aplicaciones: Es conocido que numerosos componentes naturales presentes en alimentos y bebidas Fig. 3: Resultados expresados como valores relativos del Olive Tail Moment del daño oxidativo de una línea tumoral mamaria humana (MCF7) tratada con diferentes compuestos naturales. En el eje de considerados saludables ordenadas tenemos el número relativo de células expresado como porcentaje, y en el eje de abscisas como frutas, verduras, los rangos de valores OTM en los que se encuentran las células. aceite de oliva, vinos, infusiones, etc. poseen propiedades antioxidantes, pero son escasas las evidendos para el recuento de estas cias científicas que demuestren células, facilitando en gran su protección al ADN ante una medida el trabajo en laboraLa electroforesis situación de desequilibrio oxitorio al agilizar la recolección unicelular alcalina de la información, el análisis dativo. La electroforesis unicelular alcalina puede aportar una de los resultados y su interes una herramienta pretación, y la exportación a valiosa información sobre la potencial capacidad que, un deterhojas de cálculo para análisis minado componente bioactivo posteriores, aunque se podría muy útil en la presente en los alimentos, tiene utilizar cualquier programa de determinación del análisis de imágenes de fluo- para prevenir el daño oxidativo en nuestra células. rescencia. Este estudio de la prevención La interpretación de los redaño genotóxico en antioxidativa se puede realizar sultados del Comet son comtanto en líneas celulares conplicados ya que no hay una regeneral cretas que nos interese estudiar, lación simple entre la cantidad como en células tumorales de de daño al ADN causado por tejidos determinados, líneas un compuesto y el impacto bioterpretación de estos resultados monocitarias, cultivos prilógico del daño. Los parámetros en los que la intensidad de la marios, células vegetales, etc., más utilizados para cuantificar señal es un factor determinante. como en estudios del efecto los resultados por ser los que El recuento celular se reagenotóxico en modelos animamás información proporcionan liza mediante microscopía de les, ecotóxico, y pro-oxidante o son: “tail % intensity”, “tail lengfluorescencia con una cámara antioxidante de determinadas th” y “Olive tail moment”, aunCCD (Charge Coupled Devisustancias de interés, asimisque existen muchos otros. ce) acoplada para detectar la mo, para estudios del efecto de “Tail length” es la distancia intensidad de fluorescencia o determinados alimentos, suplehasta la que ha migrado el ADN mediante microscopía óptica mentos alimenticios o medicadesde la cabeza. “Tail % intensi se ha optado por la marcamentos en pacientes con patosity” es la intensidad relativa de ción colorimétrica. Es recologías concretas que cursan con fluorescencia, y por tanto de mendable contar entre 50 y inflamación y desequilibrios ADN, de la cola respecto a la de 100 células por cada muestra, oxidativos, como la diabetes, la cabeza. Y por último, “Olive siendo más preciso nuestro artritis reumatoide, Alzheimer, tail moment” (OTM) es el proresultado cuanto mayor sea enfermedades cardiovasculares, ducto de la longitud de la cola el número de células cuantifiarteriosclerosis, determinados por la cantidad relativa de ADN cadas. Existen en el mercado tipos de cáncer, etc. o el seguicontenido en la cola. software específicos optimiza74

MARZO/ABRIL11

miento de poblaciones concretas bien con diferentes hábitos alimenticios, bien sujetos a condiciones ambientales adversas, radiaciones, fumadores, etc. Conclusiones: El uso de la electroforesis unicelular alcalina o “Comet Assay” es una herramienta muy útil en la determinación del daño genotóxico en general, y muy especialmente en el daño oxidativo al ADN generado en células u organismos. El creciente número de publicaciones en los que se aplica esta técnica, así como su implantación como técnica de rutina en hospitales europeos pioneros, avalan su aplicabilidad y el potencial interés de sus resultados. Esta técnica nos permite estudiar el comportamiento de determinados componentes alimenticios en la prevención del daño oxidativo al ADN, así como de alimentos completos en animales o poblaciones concretas o la monitorización del efecto preventivo de patrones dietéticos en poblaciones con un alto riesgo genotóxico. Bibliografía: #EMELI % "AUMGARTNER! !NDERSON $!NTIOXIDANTS AND THE #OMET ASSAY Mutation Research - Reviews in Mutation Research 2009;      -ATEOS3 $AZA0 $OMÓNGUEZ) #ÉRDENAS*! #ORTÏS&'ENOTOXICITYDETECTEDINWILDMICELIVING IN A HIGHLY POLLUTED WETLAND AREA IN SOUTH WESTERN3PAINEnvironmental Pollution    /LIVE 0, "ANATH *0 $URAND 2%(ETEROGENEITY IN RADIATION INDUCED $.! DAMAGE AND REPAIR IN TUMOR AND NORMAL CELLS MEASURED USING THE @COMET ASSAY Radiation Research      /STLING / *OHANSON +* -ICROELECTROPHORETIC STUDYOFRADIATION INDUCED$.!DAMAGESININDIVIDUAL MAMMALIAN CELLS "IOCHEM "IOPHYS 2ES #OMMUN   3INGH.0 -C#OY-4 4ICE22 3CHNEIDER%,! SIMPLETECHNIQUEFORQUANTITATIONOFLOWLEVELSOF $.!DAMAGEININDIVIDUALCELLSExperimental Cell Research  7ARLETA & #AMPOS - !LLOUCHE9 3ÉNCHEZ 1UESADA# 2UIZ -ORA* "ELTRÉN' 'AFORIO**3QUALENE PROTECTS AGAINST OXIDATIVE $.! DAMAGE IN -#&!HUMANMAMMARYEPITHELIALCELLSBUTNOT IN-#&AND-$! -" HUMANBREASTCANCER CELLSFood and Chemical Toxicology   

&!2-%30!»!).$5342)!,

J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 121–130

121

DOI:10.1021/jf102319y

Antioxidant, Antiproliferative, and Pro-apoptotic Capacities of Pentacyclic Triterpenes Found in the Skin of Olives on MCF-7 Human Breast Cancer Cells and Their Effects on DNA Damage YOSRA ALLOUCHE,†,‡ FERNANDO WARLETA,† MARI´A CAMPOS,† CRISTINA SA´NCHEZ-QUESADA,† MARINO UCEDA,‡ GABRIEL BELTRA´N,‡ AND JOSE´ JUAN GAFORIO*,† †

Immunology Division, Department of Health Sciences, Faculty of Experimental Sciences, University of Jae´n, Campus Las Lagunillas s/n, 23071 Jae´n, Spain, and ‡IFAPA Centro “Venta del Llano”, Junta de Andalucı´ a, P.O. Box 50, Mengibar, Jae´n E-23620, Spain

This research aimed to investigate erythrodiol, uvaol, oleanolic acid, and maslinic acid scavenging capacities and their effects on cytotoxicity, cell proliferation, cell cycle, apoptosis, reactive oxygen species (ROS) level, and oxidative DNA damage on human MCF-7 breast cancer cell line. The results showed that erythrodiol, uvaol, and oleanolic acid have a significant cytotoxic effect and inhibit proliferation in a dose- and time-dependent manner. At 100 μM, erythrodiol growth inhibition occurred through apoptosis, with the observation of important ROS production and DNA damage, whereas uvaol and oleanolic acid growth inhibition involved cell cycle arrest. Moreover, although all tested triterpenes did not show free radical scavenging activity using ABTS and DPPH assays, they protected against oxidative DNA damage at the concentration 10 μM. Uvaol and oleanolic and maslinic acids, tested at 10 and 100 μM, also reduced intracellular ROS level and prevented H2O2-induced oxidative injury. Overall, the results suggest that tested triterpenes may have the potential to provide significant natural defense against human breast cancer. KEYWORDS: Pentacyclic triterpenes; Olea europaea; olive oil; human breast cancer; antiproliferative activity; cell cycle arrest; apoptosis; antioxidant activity; DNA damage

INTRODUCTION

Breast cancer is the leading cause of mortality in women in developing countries (1). Of all environmental factors known to influence breast cancer, diet appears to be one of the most significant (2). Table olives and olive oil constitute regular dietary components of the traditional Mediterranean diet, which has been associated with a low incidence and prevalence of certain types of cancers, including breast cancer (3, 4). This healthy property is mainly ascribed to oleic acid (5), phenolic compounds (6), and squalene (7,8). Nonetheless, other minor components have showed relevant interesting activities. Among them, erythrodiol, uvaol, oleanolic acid, and maslinic acid (Figure 1) are the main pentacyclic triterpenes located in the skin of olive fruits (9). These constituents are present in virgin olive oil (10) with higher concentration in olive pomace oil (11, 12). Among other biological activities, including anti-inflammatory and cardioprotective (13-15), these triterpenes were reported to possess antioxidant and antitumor properties. Indeed, they were shown to prevent lipid peroxidation (16, 17), protect low-density lipoproteins (LDL) against oxidation (15,18), and suppress superoxide anion generation (19, 20). Furthermore, these bioactive compounds were found to inhibit the growth of tumor cell lines from various human cancers (21-25). Despite

these numerous papers, to the authors’ best knowledge, to date there are no available studies regarding the effects of these triterpenes on breast cancer cells. Therefore, the present study was undertaken to investigate the antioxidant capacity of erythrodiol, uvaol, oleanolic acid, and maslinic acid and its relationship to their antiproliferative capacity and oxidative DNA damage protection, using MCF-7 cells as a model for malignant breast cancer cells. For this purpose, we studied triterpenes’ scavenging activity and their effects on cell growth, cell cycle profile, apoptosis, intracellular oxidative stress, and DNA oxidative damage. MATERIALS AND METHODS

*Author to whom correspondence should be addressed (e-mail [email protected]; phone 0034 953212002; fax 0034 953212943).

Chemicals and Reagents. The following reagents were purchased from Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO): Hepes buffer; sodium pyruvate; nonessential amino acids mixture 100 (NEAA); 20 ,70 -dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA); 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2Htetrazolium-5-carboxanilide inner salt (XTT sodium salt); 5-methylphenazinium methyl sulfate, N-methylphenazonium methyl sulfate (PMS); DL-allrac-R-tocopherol (vitamin E); 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2carboxylic acid (Trolox); 2,2-diphenyl-1-picylhydrazyl (DPPH); 2,20 azinobis(3-ethylbenzthiazolie-6-sulfonic acid) diammonium salt tablets (ABTS); phosphate buffer saline (PBS); and Hank’s buffered salt solution (HBSS). Minimum essential medium with Eagle’s salts (MEM), fetal bovine serum (FBS), and phenol-red-free Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) were obtained from PAA Laboratories GmbH (Pasching, Austria). TrypLE Express and propidium iodide (PI) were

© 2010 American Chemical Society

Published on Web 12/10/2010

pubs.acs.org/JAFC

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J. Agric. Food Chem., Vol. 59, No. 1, 2011

Figure 1. Chemical structures of erythrodiol, uvaol, oleanolic acid, and maslinic acid. obtained from Invitrogen (Eugene, OR). K2S2O8 was obtained from Panreac Quimica S.A.U (Barcelona, Spain). Culture plates were obtained from NUNC (Roskilde, Denmark). The PI/RNase Staining Buffer kit, FITC-conjugated annexin V, and binding buffer were obtained from BD Biosciences Pharmigen (San Diego, CA.). The comet assay kit was purchased from Trevigen, Inc. (Helgerman CT, Gaithersburg, MD). Erythrodiol, uvaol, and oleanolic acid (purity g 97, 98.5, and 99%, respectively) were purchased from Extrasynthese (Genay, France). Maslinic acid (purity > 80%) was provided by Dr. A. Garcia-Granados, Department of Organic Chemistry, University of Granada, Spain, and was obtained according to the patented method (26). Stock solutions of these compounds were prepared in ethanol and frozen at -20 °C until use. For cell experiments, these stock solutions were then diluted in MEM to reach the desired concentration. The final concentration of ethanol in the medium was <0.6% for the highest concentration tested and had no significant effect on cell viability. Controls also received the same amount of ethanol in all experiments. ABTS Radical Scavenging Assay. ABTS cation radical scavenging activity was determined using a previously reported procedure (27). ABTS radicals (ABTS•þ) were obtained by ABTS/H2O 0.5 mM reaction with K2S2O8 for 16 h in the dark at room temperature. ABTS•þ was diluted in ultrapure water until the absorbance at 734 nm was 0.7 ((0.1). Stock solutions of tested triterpenes and Trolox (as antioxidant reference) in ethanol (10 mM) were diluted with ultrapure water to reach the assayed concentrations. Triterpene concentrations ranged from 12.5 to 800 μM, whereas Trolox concentrations were from 50 to 800 μM. Twenty microliters of each concentration of triterpene, standard (Trolox), blank (ultrapure water), or ethanol control (8%) was added to a 96-well plate. The reaction was initiated by the addition of 280 μL of ABTS•þ. Absorbance readings were taken every 5 min at 30 °C during 120 min in a microplate reader (TECAN, GENios Plus). All determinations were carried out in triplicate. The inhibition of ABTS•þ was calculated according to the following percentage of free radical scavenging activity (% RSA) formula: % RSA ¼ ½ðACð0Þ - AAðtÞ Þ=ACð0Þ  100 Where AC(0) is the absorbance of the control (blank) at t = 0 and AA(t) is the absorbance in the presence of the triterpene or standard sample at t = 60 min. DPPH Free Radical Scavenging Assay. The antioxidant activity of the tested triterpenes against the stable radical DPPH was measured as previously reported by Brand-Williams et al. (28) with some modifications. Briefly, a 100 μM ethanolic solution of DPPH was mixed with different ethanolic solutions of triterpenes in 96-well plates at 0.13, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, and 10 mol of antioxidant/mol of DPPH. R-Tocopherol was used as a standard antioxidant control in the range of concentration 0.13-1.00 mol ratio. A sample without antioxidant was also measured as a blank control. The decrease in absorbance at 520 nm was determined immediately and every 5 min during 120 min in a microplate reader (TECAN GENios plus). Measurements were performed in triplicate. The inhibition of DPPH radical was calculated according to the percentage of free radical scavenging activity (% RSA) described above (at t = 60 min).

Allouche et al. Cell Lines and Culture. The MCF-7 (primary human breast cancer) cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) and was maintained at 37 °C in a humidified atmosphere under 5% CO2 in MEM supplemented with 10% FBS, 1% Hepes buffer, 1% sodium pyruvate, and 1% NEAA. Cells in the exponential growth phase were used for all experiments. MDA-MB-231 (metastatic human breast cancer) and U937 (human histiocytic lymphoma) cell lines were used to compare the effect of triterpenes on apoptosis induction. These cell lines were cultivated using the same MCF-7 culture conditions. Cytotoxicity Assay. The effect of the tested triterpenes on cell viability was determined by the XTT assay, which is based on the ability of live cells to cleave the tetrazolium ring, thus producing formazan, which absorbs at 570 nm (29). A total of 5  103/well MCF-7 cells were grown onto 96-well plates for 24 h prior to treatment with increasing concentrations of triterpenes, from 12.5 to 100 μM, for another 24 h. Thereafter, plates were incubated with XTT in RPMI without phenol red for 3 h, and absorbance was measured at 450 nm wavelength (620 nm as reference) in a plate reader (TECAN GENios Plus). All measurements were performed in triplicate, and each experiment was repeated at least three times. Cell Proliferation Assay. In the proliferation assay, MCF-7 cells were seeded at a density of 2  103/well onto 96-well culture plates and allowed to adhere for 24 h. Thereafter, medium was replaced with fresh medium containing increasing concentrations of tested triterpenes, from 12.5 to 100 μM, and plates were incubated for 24, 48, or 120 h. After each time point, medium was substituted by a fresh culture medium and cells were allowed a proliferation period of 120, 96, or 24 h, respectively. Then, plates were incubated with XTT in RPMI without phenol red for 3 h, and absorbance was measured at 450 nm wavelength (620 nm as reference) in a plate reader (TECAN GENios Plus) (8). All measurements were done in triplicate, and each assay was made twice. Cell Cycle Assay. MCF-7 cells were seeded in 12-well culture plates at a density of 1  105/well. After 24 h, the cells were treated with or without (control) 10 and 100 μM triterpenes under study and incubated for an additional 24 h. They were then fixed with cold 70% ethanol and stored at -20 °C for at least 24 h. Cells were subjected to flow cytometry analysis on an EPICS XL-MCL cytofluorometer (Beckman Coulter, Spain) after propidium iodide labeling (PI/RNase staining buffer). The percentage of cells in sub G1, G0/G1, S, and G2/M phases was calculated using the FlowJo program (v5.7.2). The experiment was repeated at least three independent times. Apoptosis Assay. The percentage of apoptotic cells was determined using a double staining assay with FITC-conjugated annexin V and propidium iodide (PI). MCF-7 cells (1  105/well) in 12-well culture plates were treated after 24 h with or without 10 and 100 μM triterpenes for another 24 h. Subsequently, cells were harvested, washed twice in cold PBS, and resuspended in 100 μL of annexin binding buffer. Cells were stained with 5 μL of annexin V-FITC and 1 μL of PI solution, gently vortexed, and incubated for 15 min at room temperature in the dark before flow cytometric analysis. The experiment was repeated at least three independent times. Detection of Intracellular Reactive Oxygen Species. The generation of intracellular reactive oxygen species (ROS) was evaluated on the basis of the intracellular peroxide-dependent oxidation of DCFH-DA to form a fluorescent compound, DCF, as described by Warleta et al. (8). Briefly, MCF-7 cells were seeded at a density of 1  104/well on 96-well plates and grown for 24 h to allow adhesion. Subsequently, the medium was substituted with a fresh one containing 1, 10, or 100 μM tested triterpenes, and cells were incubated for another 24 h. Thereafter, cells were washed two times with HBSS and incubated with fresh DCFH-DA (100 μM) for 30 min at 37 °C in 5% CO2. Cells were then washed twice and read in a plate reader for 30 min (Ex λ485/Em λ535, gain 60). The intracellular ROS level percentage was calculated as F ¼ ½ðF t¼30 - F t¼0 Þ=F t¼0  100 where Ft=0 is the fluorescence at t = 0 min and Ft=30 the fluorescence at t = 30 min. Hydrogen peroxide (H2O2), a widely used model of in vitro oxidative stress, can directly damage DNA, lipids, and other macromolecules, causing oxidative injury to the cell (30). To evaluate whether erythrodiol, uvaol, oleanolic acid, or maslinic acid is able to reduce induced oxidative

Article

J. Agric. Food Chem., Vol. 59, No. 1, 2011 •þ

Table 1. Percentage of Free Radical Scavenging Activity of Erythrodiol, Uvaol, Oleanolic Acid and Maslinic Acid Measured by Decolorization of ABTS Reduction of the DPPH Radical (B)a

123 (A) and

(A)

12.5 μM 25 μM 50 μM 100 μM 200 μM 400 μM 800 μM

Trolox

erythrodiol

uvaol

oleanolic acid

maslinic acid

ne ne 17.61 ( 0.38 32.77 ( 0.77 58.70 ( 1.32 94.99 ( 0.77 99.06 ( 0.24

3.49 ( 0.34 2.61 ( 0.39 2.74 ( 0.26 2.30 ( 0.41 2.83 ( 0.56 2.08 ( 0.64 2.28 ( 0.16

4.08 ( 0.55 3.59 ( 0.36 3.57 ( 0.63 5.02 ( 0.86 5.25 ( 1.04 4.37 ( 1.05 4.60 ( 1.36

3.69 ( 0.43 3.19 ( 0.39 3.19 ( 0.43 2.66 ( 0.66 3.62 ( 1.09 5.92 ( 1.76 5.60 ( 1.67

4.39 ( 0.36 3.91 ( 0.24 4.83 ( 0.49 4.34 ( 0.37 5.86 ( 0.46 10.03 ( 0.68 18.32 ( 0.86

(B) mol AH/mol/DPPH

R-tocopherol

erythrodiol

uvaol

oleanolic acid

maslinic acid

0.13 0.25 0.50 1.00 2.50 5.00 10.00

44.33 ( 1.71 71.64 ( 2.10 81.50 ( 1.25 81.24 ( 1.19 ne ne ne

; ; ; ; 3.47 ( 1.14 3.35 ( 0.69 8.24 ( 0.63

2.86 ( 0.63 1.69 ( 0.65 1.46 ( 0.61 2.26 ( 0.57 4.40 ( 0.64 3.42 ( 0.69 12.51 ( 1.19

; ; ; 0.60 ( 0.35 3.42 ( 0.29 2.61 ( 0.61 10.48 ( 1.08

0.20 ( 0.07 0.33 ( 0.11 0.75 ( 0.22 2.08 ( 0.11 24.45 ( 0.23 42.37 ( 0.44 71.93 ( 0.38

a Trolox and R-tocopherol were used as standard antioxidants control. Values represent the mean ( SEM of three independent experiments at t = 60 min. ne, not estimated. ;, free radical scavenging capacity was not detected.

stress, cells were challenged with 500 μM H2O2 30 min before fluorescence quantification. All measurements were performed in triplicate, and each experiment was repeated at least three times. Alkaline Single-Cell Gel Electrophoresis (Comet Assay). MCF-7 cells were seeded at the density of 1  105/well into 12-well plate cultures. After 24 h, they were treated with or without 10 and 100 μM triterpenes for an additional 24 h. They were then scraped, washed twice (300g, 10 min, 4 °C) with cold 1 PBS (Ca2þ/Mg2þ free), and resuspended in 1 mL of cold 1 PBS. After that, the comet assay was performed according to the method of Warleta et al. (8). To assess whether triterpenes are able to protect against oxidative DNA damage, cell suspensions were exposed for 10 min to 50 μM H2O2 at 4 °C. Cells washed twice with cold 1 PBS and resuspended in 1 mL of cold 1 PBS were then subjected to the comet assay procedure. Slide Scoring and Analysis. DNA strand breaks were examined in a fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200) equipped with a Luca EMCCD camera (Andor Technology, Belfast, U.K.) under 494 nm excitation and 521 nm emission wavelength using the Komet 5.5 software package (Kinetic Imaging Ltd., Liverpool, U.K.). Fifty cell images were randomly characterized per sample using 20 magnification. Relative fluorescence between head and tail through the Olive tail moment (Olive_TM) was used to determine DNA damage. Statistical Analysis. The results of free radical scavenging activity of tested triterpenes (% RSA) are presented as the mean of three independent experiments ( the standard error of the mean (SEM). For cell assays, data are displayed as the mean of at least three independent experiments ( SEM, and results are expressed as a percentage relative to the untreated control cells, which was defined as 100%. A general variance analysis (ANOVA) was carried out on all data followed by Fisher’s LSD test. A p value of <0.05 was considered to be statistically significant. These statistical analyses were performed using Statgraphics Plus 5.1 statistical software (Statpoint Technologies, Inc., Warranton, VA). RESULTS

Antioxidant Activity. The free radical scavenging capacity of triterpenes under study was evaluated by means of ABTS and DPPH assays. As shown in Table 1, erythrodiol, uvaol, and oleanolic acid have shown a weak free radical scavenging activity in both tests. Maslinic acid also exhibited a weak antiradical

activity up to 800 μM and 2.50 mol ratio; however, from 5.00 mol ratio, a high DPPH scavenging activity was observed (RSA > 70% at 10.00 mol ratio). Effects of Triterpenes on Cell Survival. MCF-7 cells were exposed to increasing concentrations, from 12.5 to 100 μM, of erythrodiol, uvaol, oleanolic acid, and maslinic acid for 24 h, and then cell survival, compared with untreated controls, was evaluated using the XTT assay. As shown in Figure 2, the percentage of living cells decreased in a dose-dependent manner, respectively, from 25 and 50 μM erythrodiol and uvaol. It is worth noting that at the same concentration of 100 μM, the cytotoxic effect induced by erythrodiol was significantly stronger than that induced by uvaol (respectively, 12 and 64% of the cells still viable). Related to triterpenic acids, cell survival dropped slightly by 50 or 100 μM oleanolic acid (89% of the cells still viable), whereas it was unaffected by the presence of maslinic acid. Effects of Triterpenes on Cell Proliferation. The effects of tested triterpenes on MCF-7 cell proliferation was evaluated with concentrations ranging from 12.5 to 100 μM after 24, 48, and 120 h of exposure (Figure 3). A dose- and time-dependent decrease in cell proliferation rate was achieved by erythrodiol and oleanolic acid. Cell proliferation was almost completely inhibited 24 h after MCF-7 exposure to 50 μM erythrodiol and 100 μM oleanolic acid (Figure 3A,C). Uvaol, however, showed a biphasic behavior; an increase in proliferation rate was observed at the concentration of 12.5 μM, followed by a dose- and timedependent proliferation inhibition from 25 μM (Figure 3B). Finally, maslinic acid increased the MCF-7 cell proliferation rate (Figure 3D). Effects of Triterpenes on Cell Cycle and Apoptosis. Figure 4 shows the effects of triterpenes on the different phases of the cell cycle. MCF-7 treatment with 10 μM erythrodiol induced a significant increase in the population in G0/G1 phase (8%), whereas a 100 μM concentration of this compound caused a marked decrease in the percentage of cells in G0/G1 (33%) and an increase in the percentage of cells in sub G1 phase (10-fold higher than untreated control cells) (Figure 4A). This sub G1 is normally associated with apoptosis. When cells were treated with a 10 μM

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Figure 2. Effects of triterpenes on MCF-7 cell survival. Cells were treated with different concentrations of erythrodiol, uvaol, oleanolic acid, and maslinic acid for 24 h, and then cell survival was determined by the XTT assay. The results represent the mean ( SEM of three independent experiments. / denotes statistically significant difference compared with control, which was considered to be 100% (p < 0.05).

concentration of either uvaol or oleanolic acid, no changes on cell cycle profiles were detected with respect to untreated controls. At the concentration of 100 μM, uvaol induced a significant increase in G0/G1 phase (8%) and a decrease in S phase (41%) (Figure 4B). Similarly, 100 μM oleanolic acid caused an increase in the population in G0/G1 (18%), with a concomitant decrease in the percentage of cells in the S phase (50%) and G2/M phase (34%) (Figure 4C). At both concentrations tested, maslinic acid did not induce significant change in the cell cycle profile (Figure 4D). Assessment of apoptosis was performed by flow cytometry using annexin V-FITC and PI labeling, and the percentage of apoptotic cells was calculated from the ratio of the sum of early plus late apoptotic cells. Consistent with cell cycle analysis, 100 μM erythrodiol strongly induced apoptosis (the apoptotic rate increased from 12% in control untreated cells to 64%), whereas no effect on apoptosis induction was observed by the rest of the triterpenes (Figure 5A). In the same way, 100 μM erythrodiol strongly induced apoptosis in MDA-MB-231 and U937 cells (the apoptotic rate increased from 7 to 83% and from 1 to 80%, respectively). The rest of the triterpenes did not induce apoptosis in MDA-MB-231, but they did in U937 cells (Figure 5B). Effects of Triterpenes on Intracellular ROS Level. Measurement of intracellular ROS level using the DCFH-DA probe showed a significant decrease in ROS level in MCF-7 cells after 24 h of treatment with uvaol, oleanolic acid, and maslinic acid. However, in the case of erythrodiol, a marked increase in intracellular ROS level was observed at the concentration of 100 μM, whereas no significant effect was observed at a 1 or 10 μM concentration of this triterpene (Figure 6A). To induce intracellular oxidative stress, H2O2 was added before fluorescence measurement. As shown in Figure 6B, H2O2 induced oxidative injury on MCF-7 cells. Thereafter, to investigate the in vitro preventive effect of triterpenes against H2O2 oxidative injury, the intracellular ROS level was measured in MCF-7 cells previously treated with 1, 10, and 100 μM triterpenes. Our results revealed that uvaol, oleanolic acid, and maslinic acid protected against oxidative injury as compared to H2O2 control cells in the range of concentrations tested, whereas, as expected, 100 μM erythrodiol did not show any protective effect, showing again an important increase in intracellular ROS level. Effects of Triterpenes on DNA Integrity and H2O2-Induced DNA Damage. The effects of triterpenes under study on DNA integrity and H2O2-induced DNA damage in MCF-7 cells was evaluated using alkaline single-cell gel electrophoresis (comet assay),

and results were expressed as Olive_TM. Olive_TM incorporates a measure of both the smallest detectable size of migrating DNA (reflected in the comet tail length) and the number of relaxed/ broken pieces (represented by the intensity of DNA in the tail) (31). Results showed that neither uvaol, oleanolic acid, or maslinic acid, at both doses tested, nor erythrodiol, at the lowest dose, affected DNA integrity. However, significant DNA damage was produced by 100 μM erythrodiol as compared with control (Figure 7A). MCF-7 treatment with 50 μM H2O2 alone for 10 min (control H2O2) significantly increased Olive_TM when compared with control (Figure 7B). Preincubation of MCF-7 cells with a 10 μM concentration of either erythrodiol, uvaol, or oleanolic acid exerted a preventive effect against H2O2-induced DNA damage (respectively, 63, 43, and 26% reduction), whereas at 100 μM no longer was a preventive effect observed. Otherwise, MCF-7 cells treated with maslinic acid significantly decreased the formation of single-strand breaks (up to 76% reduction at 100 μM) (Figure 7B). DISCUSSION

In the present study, we have focused on erythrodiol, uvaol, oleanolic acid, and maslinic acid, four pentacyclic triterpenes found in Olea europaea (9-12). Previous papers have described the antiproliferative properties of these triterpenes against various cancer cells (21-25). However, their antitumor capacity against breast cancer has not yet been studied. Here, we report on the antiproliferative and antioxidant capacities of these triterpenes in the MCF-7 human breast cancer cell line, the first such study to date. Our results suggest that tested triterpenes may have the potential to provide significant natural defense against human breast cancer. This conclusion is based on the following findings: antiproliferative and cytotoxic effects, cell cycle arrest and/or induction of apoptosis, reduction of intracellular ROS level, and prevention against oxidative DNA damage, all depending on dose and chemical structure. Cytotoxicity, a common preliminary method, is helpful to determine whether tested compounds have potential antineoplastic properties (32). Furthermore, increased proliferation and decreased cell death (apoptosis) are two major processes that contribute to the progression of tumor cell growth. The cytotoxic effect of oleanolic and maslinic acids has been previously reported on several tumor cell lines such as A549 (non-small-cell lung cells), SK-OV-3 (ovary), SK-MEL-2 (melanoma), XF-498 (central nervous system), HCT-15 (colon), HSC-2 (oral squamous cell carcinoma), and

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Figure 3. Effects of triterpenes on MCF-7 cell proliferation. Cells were treated with different concentrations of erythrodiol (A), uvaol (B), oleanolic acid (C), and maslinic acid (D) for 24, 48, and 120 h, and then cell proliferation, using the XTT assay, was determined after a proliferation period of up to 6 days. The results represent the mean ( SEM of two independent experiments and are expressed as percentage of the control, which was defined as 100%. / denotes statistically significant difference between concentrations for each time (p < 0.05). Different letters denote statistically significant difference between times for each concentration (p < 0.05).

HSG (salivary gland tumor) (33, 34). In addition, the antiproliferative capacity of erythrodiol, uvaol, oleanolic, and maslinic acids was described in Caco-2 and HT-29 colon cancer cell lines (21-23) and in 1321N1 astrocytoma cell line (24, 25). In this study, our results showed that erythrodiol, uvaol, and oleanolic acid significantly inhibited cell growth and proliferation in a dose- and

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Figure 4. Effects of triterpenes on MCF-7 cell cycle distribution. Cells treated with 10 and 100 μM erythrodiol (A), uvaol (B), oleanolic acid (C), and maslinic acid (D) for 24 h were collected and stained with PI after fixation by 70% ethanol. Following flow cytometry, cell cycle distribution was analyzed using the FlowJo program. The results represent the mean ( SEM of four independent experiments. / denotes statistically significant difference compared with control (p < 0.05).

time-dependent manner, the effect of erythrodiol being more pronounced. Hence, these data suggest that these triterpenes effectively reduced the malignancy and suppressed the generation

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Figure 5. Effects of triterpenes on apoptosis induction on MCF-7 (A) and MDA-MB-231 and U937 cells (B). Cells treated with 10 and 100 μM erythrodiol, uvaol, oleanolic acid, and maslinic acid for 24 h were collected and stained with FITC-conjugated annexin V and PI. Following flow cytometry, the percentage of apoptotic cells was calculated from the ratio of the sum of early plus late apoptotic cells using the FlowJo program. The results represent the mean ( SEM of three independent experiments. / denotes statistically significant difference compared with control (p < 0.05).

potential of cancer cells. Uvaol showed a significant proliferative effect at the lowest dose of 12.5 μM. It has been reported that at low doses, certain antioxidants can stimulate the growth of some types of cancer. For instance, vitamin C was found to stimulate the growth of both human parotid carcinoma cells and human leukemic cells in vitro (35), and vitamin E was found to enhance the growth of various prostate cancer cell lines (36). Future work is needed to clarify the mechanism of stimulation of cancer cell growth by some antioxidants. It has been reported that some anticancer agents cause growth inhibition through interfering with the processes of cell cycle (37) and some others cause cell death by apoptosis (38). On the one hand, cell cycle is under strict regulation in the cell with numerous control points that allow correct progression of the different phases. In this sense, a delay in progression of the G0/G1, S, or G2/M cell cycle phases would constitute a cellular defense mechanism to allow action of the DNA repair systems (39). On the other hand, apoptosis is considered to be a physiologically important process that functions to eliminate undesired cells during development and homeostasis of multicelular organisms. Therefore, to determine whether cell cycle arrest or apoptosis is involved in growth inhibition, we examined cell cycle phase distribution and induction of apoptosis of the triterpene-treated cells by flow cytometry. Our results indicated that at the concentration of 100 μM, uvaol and oleanolic acid inhibition of proliferation appeared to result from inhibition of cell cycle progression, because these compounds were found to be involved in the action of the G0/G1 checkpoint and inhibition of DNA replication. The

literature lacks studies on the potential antiproliferative capacity of uvaol. Nonetheless, recently Martı´ n et al. (25) reported that uvaol growth-inhibiting activity is associated with the induction of apoptosis in 1321N1 astrocytoma cells. These authors observed that exposure of 1321N1 cells to 50 and 100 μM uvaol for 18 h induces apoptosis around 40-60%. Instead, and in agreement with our results, Li et al. (40) and Cipak et al. (41) reported that oleanolic acid, at the concentration of 60 μM, inhibition of proliferation occurred through G0/G1 phase arrest, respectively, after 72 and 24 h of exposure in HCT-15 colon adenocarcinoma cell line and HL-60 leukemic cell line. By contrast, in another study it was found that oleanolic acid inhibition of proliferation is mediated via apoptosis in 1321N1 astrocytoma cells treated for 18 h with a 25 μM concentration of this triterpenic acid (24). Differences in uvaol and oleanolic acid responses are therefore most likely due to the specific cell type and concentration and treatment time used. Moreover, in our study, it was found that uvaol and oleanolic acid did not induce apoptosis in MDA-MB231 human breast adenocarcinoma cell line but did in U937 human leukemic cell line, and it was not dose-dependent. Otherwise, our results suggest that 100 μM erythrodiol inhibition of MCF-7 cell proliferation appeared to result from the occurrence of apoptosis. Erythrodiol was also found to strongly induce apoptosis in MDA-MB-231 and U937 cells. Our findings are in agreement with others previously reported (23, 25) describing that erythrodiol antiproliferative activity is associated with the induction of apoptosis and that erythrodiol apoptotic potential appears to be a generalized event.

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Figure 6. (A) Intracellular ROS level in MCF-7 cells after triterpene treatment. Cells were treated with different concentrations of erythrodiol, uvaol, oleanolic acid, and maslinic acid for 24 h, and then intracellular ROS level was measured by DCFH-DA probe. The results represent the mean ( SEM of three independent experiments. / denotes statistically significant difference compared with control, which was considered to be 100% (p < 0.05). (B) Capacity of triterpenes to reduce MCF-7 oxidative stress induced by H2O2 addition measured by DCFH-DA probe. The results represent the mean ( SEM of three independent experiments. / denotes statistically significant difference compared with positive control (control H2O2), which was considered to be 100% (p < 0.05).

Under our experimental conditions, incubation of MCF-7 cells for 24 h with maslinic acid did not exert any signs of cytotoxicity or alter cell cycle parameters, nor did it induce apoptosis. However, it increased proliferation rate. Our results are in contrast with others reported previously describing the antiproliferative and apoptosis-inducing effect of maslinic acid on colon and brain cancers (21, 22, 24, 42, 43). On the other hand, it was observed that maslinic acid induces apoptosis in U937 leukemic cells. Differences in susceptibility to maslinic acid may be therefore due to differences in the nature of the cell line. Further studies should be done to understand the mechanism by which maslinic acid stimulates MCF-7 cells proliferation. It has been reported that many anticancer compounds exert antitumor activity including antioxidant mechanism (44). The triterpenes under study have been previously reported to possess antioxidant properties in a variety of experimental systems (15-20). However, to the authors’ best knowledge, very little is known about the triterpenes’ free radical scavenging activity. Using ABTS and DPPH chemical assays, our results indicated that the tested triterpenes lack free radical scavenging capacity. Accordingly, Yang et al. (45) reported that oleanolic and maslinic acids did not possess DPPH scavenging capacity up to the concentration of 200 μM. Nonetheless, in our study it was found that at very high mole ratio (up to 5.00 mol), maslinic acid exhibited a high DPPH scavenging capacity. Furthermore, we recently reported that maslinic acid, unlike the rest of the triterpenes, acts as an efficient peroxyl radical scavenger as assessed by the ORAC assay (15). On the other hand, at present, overwhelming evidence indicates that ROS are involved in both the initiation and progression of cancer (46). In this sense, the cancer chemopreventive properties of antioxidants are generally believed to be due to their ability to

scavenge endogenous ROS (47). Furthermore, oxidative stress may result in an increase in oxidative damage and can be caused either by an overproduction of free radicals and ROS or by an impairment of the endogenous antioxidant system. In this paper, DCFH-DA assay results showed that uvaol and oleanolic and maslinic acids decreased significantly the steady-state generation of ROS by MCF-7 in culture. In addition, it was found that increased levels of ROS generated during the oxidative stress period (30 min of H2O2 exposure) were quenched in cells pretreated with these triterpenes. Overall, our data indicate that in the cellular system, uvaol and oleanolic and maslinic acids behaved as antioxidants, reducing both endogenous and exogenous ROS levels. On the other hand, ROS levels have been shown to play an important role in the initiation and execution of apoptosis of many anticancer compounds (48). In this sense, erythrodiol, uvaol, oleanolic acid, and maslinic acid induction of apoptosis was found to be preceded by ROS generation in astrocytome cells (24, 25). The same effect was observed by maslinic acid in HT-29 cells (42). On basis of these observations, in our study the increase in intracellular ROS level in MCF-7 cells treated with 100 μM erythrodiol may be related to apoptosis induction. Further experiments should be performed to study the detailed mechanism of apoptosis. The comet assay provides a simple and effective method for evaluating DNA damage at the single-cell level. As expected, MCF-7 cell treatment with uvaol, oleanolic acid, or maslinic acid showed no genotoxicity at both doses tested. Similarly, 10 μM erythrodiol did not induce DNA damage. By contrast, and consistent with apoptosis and ROS results, 100 μM erythrodiol was found to produce high DNA damage.

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Figure 7. (A) Effects of triterpenes on DNA integrity assessed by the comet assay. MCF-7 cells treated with 10 and 100 μM erythrodiol, uvaol, oleanolic acid, and maslinic acid for 24 h were subjected to comet assay. Olive_TM values represent the mean ( SEM. / denotes statistically significant difference compared with control, which was considered to be 100% (p < 0.05). (B) Effects of triterpenes on DNA oxidative damage induced by H2O2 addition evaluated by the comet assay. Olive_TM values represent the mean ( SEM. / denotes statistically significant difference compared with positive control (control H2O2), which was considered to be 100% (p < 0.05).

H2O2 is suggested to cause DNA strand breakage by the generation of hydroxyl radicals (OH•) through the Fenton or Fenton-like reactions (49). In fact, in our study it was found that preincubation of MCF-7 cells with H2O2 for 10 min caused marked DNA damage. Very little is known regarding the effect of the tested triterpenes against DNA-induced oxidative injury, and only Ovesna´ et al. (50) have previously reported the effect of oleanolic acid against H2O2-induced DNA damage. These authors concluded that this triterpene significantly reduced DNA-induced oxidative injury in leukemic L1210, K562, and HL-60 cells in the concentration range from 2.5 to 10 μM. In agreement, in our experiment it was found that at 10 μM, oleanolic acid, as well as erythrodiol and uvaol, exhibited a protective effect against DNA damage caused by H2O2. However, no longer was a protective capacity observed when tested at 100 μM. By contrast, maslinic acid displayed a protective capacity at both doses tested. According to Iliakis et al. (51), the DNA damage response is a hierarchical process; to allow time for DNA repair, the cells activate checkpoint pathways that delay the normal progression of the cell cycle. Checkpoints, together with repair and apoptosis, are integrated in a circuitry that determines the ultimate response of a cell to DNA damage. Therefore, our results, taken together, suggest that at low dose (10 μM), erythrodiol, uvaol, oleanolic acid, and maslinic acid in a dose-independent manner act as antioxidants scavenging superoxide and hydroxyls radicals produced by H2O2, thus preventing the impairment of mitochondrial function and consequently avoiding MCF-7 cell death. However,

the absence of protective activity against DNA-induced damage in MCF-7 cells pretreated with high doses (100 μM) of erythrodiol, uvaol, and oleanolic acid may be linked to their capacity to activate other signaling pathways, resulting in cell cycle arrest and/or apoptosis and, thus, proliferation inhibition. Additional experiments to get a better understanding of the triterpenes’ mechanisms of action are in progress. In relation to the chemical structures, these pentacyclic triterpenes can be classified as alcoholic or acid (Figure 1). Although the structure and activity relationships of these pentacyclic triterpenes are far from clear, it seems that the -CH2OH group at C-28 enhances the cytotoxic capacity of the triterpenic diols as compared to triterpenic acids (-COOH at C-28). In addition, the pro-apoptotic capacity of erythrodiol may be related to the presence of two methyl groups at C-20. Maslinic acid differs from the other triterpenes by the presence of an additional -OH group at C-2, which appears to suppress the cytotoxic effect and confer it antioxidant activity. To the authors’ best knowledge, to date, there are no studies reporting the bioavailability of these triterpenes. Therefore, it is difficult to predict the presence of these compounds or their derived metabolites in the blood after consumption of a triterpene-rich diet. In any case, the concentrations used in the present study are similar to those previously reported (21-25). In conclusion, our results provide new insight into the anticarcinogenic action of erythrodiol, uvaol, oleanolic acid, and maslinic acid in human breast cancer. Moreover, our findings

Article support the hypothesis that these triterpenes, isolated in appreciable higher amounts from the non-glyceride fraction of pomace olive oil, may be considered as valuable molecules for use as cancer chemotherapeutic or chemopreventive agents. LITERATURE CITED (1) Coughlin, S. S.; Ekuweme, D. U. Breast cancer as a global health concern. Cancer Epidemiol. 2009, 33, 315-318. (2) Michels, K. B. The contribution of the environment (especially diet) to breast cancer risk. Breast Cancer Res. 2002, 4, 58-61. (3) Escrich, E.; Ramı´ rez-Tortosa, M. C.; Sa´nchez-Rovira, P.; Colomer, R.; Solanas, M.; Gaforio, J. J. Olive oil in cancer prevention and progression. Nutr. Rev. 2006, 64, S40-S52. (4) Martin-Moreno, J. M.; Willett, W. C.; Gorgoio, L.; Banegas, J. R.; Rodriguez-Artalejo, F.; Fernandez-Rodriguez, J. C.; Maisonneuve, P.; Boyle, P. Dietary fat, olive oil intake and breast cancer risk. Int. J. Cancer 1994, 58, 774-780. (5) Binukumar, B.; Mathew, A. Dietary fat and risk of breast cancer. World J. Surg. Oncol. 2005, 3, 45. (6) Menendez, J. A.; Vazquez-Martin, A.; Oliveras-Ferraros, C.; GarciaVillalaba, R.; Carrasco-Pancorbo, A.; Fernandez-Gutierrez, A.; SeguraCarretero, A. Extra-virgin olive oil polyphenols inhibit HER2 (erb-2)induced malignant transformation in human breast epithelial cells: relationship between the chemical structures of extra-virgin olive oil secoiridoids and lignans and their inhibitory activities on the tyrosine kinase activity of HER2. Int. J. Oncol. 2009, 34, 43-51. (7) Newmark, H. L. Squalene, olive oil, and cancer risk: a review and hypothesis. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1997, 6, 1101-1103. (8) Warleta, F.; Campos, M.; Allouche, Y.; Sa´nchez-Quesada, C.; RuizMora, J.; Beltra´n, G.; Gaforio, J. J. Squalene protects against oxidative DNA damage in MCF10A human mammary epithelial cells but not in MCF7 and MDA-MB-231 human breast cancer cells. Food Chem. Toxicol. 2010, 48, 1092-1100. (9) Bianchi, G.; Murelli, C.; Vlahov, G. Surface waxes from olive fruits. Phytochemistry 1992, 31, 3503-3506. (10) Allouche, Y.; Jime´ nez, A.; Uceda, M.; Aguilera, M. P.; Gaforio, J. J.; Beltra´n, G. Triterpenic content and chemometric analysis of virgin olive oils from forty olive cultivars. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 3604-3610. (11) Pe´ rez-Camino, M. C.; Cert, A. Quantitative determination of hydroxy pentacyclic triterpene acids in vegetable oils. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 1558-1562. (12) Can˜abate-Dı´ az, B.; Segura Carretero, A.; Ferna´ndez-Gutie´ rrez, A.; Belmonte Vega, A.; Garrido Frenich, A.; Martı´ nez Vidal, J. L.; Duran Martos, J. Separation and determination of sterols in olive oil by HPLC-MS. Food Chem. 2007, 102, 593-598. (13) Ma´rquez-Martı´ n, A.; De La Puerta, R; Ferna´ndez-Arche, A.; RuizGutie´rrez, V.; Yaqoob, P. Modulation of cytokine secretion by pentacyclic triterpenes from olive pomace oil in human mononuclear cells. Cytokine 2007, 36, 211-217. (14) Rodriguez-Rodriguez, R.; Perona, J. S.; Herrera, M. D.; RuizGutie´ rrez, V. Triterpenic compounds from orujo olive oil elicit vasorelaxation in aorta from spontaneously hypertensive rats. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 2096-2102. (15) Allouche, Y.; Beltra´n, G.; Gaforio, J. J.; Uceda, M.; Mesa, M. D. Antioxidant and antiatherogenic activities of pentacyclic triterpenic diols and acids. Food Chem. Toxicol. 2010, 48, 2885-2890. (16) Montilla, M. P.; Agil, A.; Navarro, M. C.; Jimenez, M. I.; GarciaGranados, A.; Parra, A.; Cabo, M. M. Antioxidant activity of maslinic acid, a triterpene derivative obtained from Olea europaea. Planta Med. 2003, 69, 472-474. (17) Perona, J. S.; Arcemis, C.; Ruiz-Gutie´rrez, V.; Catala´, A. Effect of dietary high oleic acid oils that are rich in antioxidants on microsomal lipid peroxidation in rats. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 730-735. (18) Andrikopoulos, N. K.; Kaliora, A. C.; Assimopoulou, A. N.; Papageorgiou, V. P. Inhibitory activity of minor polyphenolic and nonpolyphenolic constituents of olive oil against in vitro low-density lipoprotein oxidation. J. Med. Food 2002, 5, 1-7. (19) Chen, G.; Lu, H.; Wang, C.; Yamashita, K.; Manabe, M.; Xu, S.; Kodama, H. Effect of five triterpenoid compounds isolated from

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130

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2010 JCR Science Edition

Rank in Category: JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY Journal Ranking For 2010, the journal JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY has an Impact Factor of 2.816. This table shows the ranking of this journal in its subject categories based on Impact Factor. Category Name

Total Journals Journal Rank Quartile in Category in Category in Category

AGRICULTURE, MULTIDISCIPLINARY

55

2

CHEMISTRY, APPLIED

70

8

Q1

128

10

Q1

FOOD SCIENCE & TECHNOLOGY

Q1

Category Box Plot For 2010, the journal JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY has an Impact Factor of 2.816. This is a box plot of the subject category or categories to which the journal has been assigned. It provides information about the distribution of journals based on Impact Factor values. It shows median, 25th and 75th percentiles, and the extreme values of the distribution.

Key

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A-

AGRICULTURE, MULTIDISCIPLINARY

B-

CHEMISTRY, APPLIED

C-

FOOD SCIENCE & TECHNOLOGY

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Food and Chemical Toxicology 48 (2010) 1092–1100

Contents lists available at ScienceDirect

Food and Chemical Toxicology journal homepage: www.elsevier.com/locate/foodchemtox

Squalene protects against oxidative DNA damage in MCF10A human mammary epithelial cells but not in MCF7 and MDA-MB-231 human breast cancer cells Fernando Warleta a, María Campos a, Yosra Allouche a,b, Cristina Sánchez-Quesada a, Jesús Ruiz-Mora a, Gabriel Beltrán b, José J. Gaforio a,* a b

Immunology Division, Department of Health Sciences, Faculty of Experimental Sciences, University of Jaén, Campus las Lagunillas s/n, 23071 Jaén, Spain Instituto Andaluz de Investigación y Formación Agraria, Pesquera y de la Producción Ecológica (IFAPA), Centro ‘‘Venta del Llano”, 23620 Mengibar, Spain

a r t i c l e

i n f o

Article history: Received 1 October 2009 Accepted 28 January 2010

Keywords: Squalene Human breast cancer Comet assay Virgin olive oil Cancer prevention

a b s t r a c t Until now, very little has been known about the antioxidant capacity of squalene and its effect on human breast tumourigenesis. In the present work, we investigated squalene’s scavenging properties and its effect on cell proliferation, cell cycle profile, apoptosis, reactive oxygen species (ROS) level and oxidative DNA damage, using human breast cell lines. Our results showed that squalene neither possesses scavenging activity nor significantly alters cell proliferation rates, the cell cycle profile or cell apoptosis in human mammary epithelial cells (MCF10A), minimally invasive (MDA-MB-231) breast cancer cells, and highly invasive (MCF7) breast cancer cells. However, we found that squalene did exert the following effects on MCF10A epithelial cells in a dose-dependent manner: (a) it decreased intracellular ROS level, (b) it prevented H2O2-induced oxidative injury, and (c) it protected against oxidative DNA damage. Interestingly, squalene did not exert these effects on MCF7 and MDA-MB-231 cancer cells. Therefore, our data suggest that squalene, found in high amounts in virgin olive oils, could be partially responsible for the lower incidence of breast cancer in populations that consume the Mediterranean diet due to its protective activity against oxidative DNA damage in normal mammary cells. Ó 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduction Olive oil is the principal source of fat in the Mediterranean diet (Pérez-Jiménez et al., 2005). Consumption of olive oil has been associated with a low incidence and prevalence of cancer, including breast cancer (Escrich et al., 2006; Owen et al., 2000a). It has been suggested that the lower risk of breast cancer associated with high olive oil consumption may be due to the presence of squalene (Newmark, 1997).

Abbreviations: AAPH, 2,20 -azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride; ABTS, 2,20 -azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid); CPT, camptothecin; DCFH-DA, 20 ,70 -dichlorofluorescein diacetate; DMSO, dimethyl sulfoxide; DPPH, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl; EDTA, ethylenediaminetetraacetic acid; EMCCD, electron-multiplying charge coupled device; FBS, foetal bovine serum; FITC, fluorescein isothiocyanate; FL, fluorescein; HBSS, Hank’s balanced salt solution; HuMEC, human mammary epithelial cells medium; LMA, low melting point agarose; MEM, minimum essential medium; NEAA, non-essential amino acids; NMA, normal melting point agarose; ORAC, oxygen radical absorbance capacity; PBS, phosphate buffer saline; PI, propidium iodide; PMS, phenazine methosulphate; ROS, reactive oxygen species; RPMI, Roswell park memorial institute 1640 medium; TOC, a-tocopherol; XTT, (30 -{1-[(phenylamino)-carbonyl]-3,4-tetrazolium}-bis(4methoxy-6-nitro) benzenesulfonic acid hydrate). * Corresponding author. Tel.: +34 953212002; fax: +34 953211851. E-mail address: [email protected] (J.J. Gaforio). 0278-6915/$ - see front matter Ó 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi:10.1016/j.fct.2010.01.031

Squalene (2,6,10,15,19,23-hexamethyl-2,6,10,14,18,20-tetracosahexane) is a triterpenic hydrocarbon present at high concentrations in shark liver and virgin olive oils. In virgin olive oil, it is the major hydrocarbon (more than 90%), with content ranging from 0.8 to 13 g/kg (Allouche et al., 2007; Cert et al., 2000; Owen et al., 2000b). Squalene, an intermediate metabolite in cholesterol metabolism, is considered a remarkable bioactive substance, with several interesting biological activities, including antioxidant and antitumour properties (Owen et al., 2000a). Indeed, in vitro experimental evidence indicates that this compound is a highly effective singlet oxygen scavenging agent (Saint-Leger et al., 1986) and a chemopreventive agent against chemically-induced cancer (Smith, 2000; Sotiroudis and Kyrtopoulos, 2008). Moreover, squalene is able to inhibit aberrant hyperproliferation, an event that precedes mammary tumourigenesis in vivo (Katdare et al., 1997), and to play a tumour-inhibiting role in animal models (Murakoshi et al., 1992; Newmark, 1997; Rao et al., 1998). Despite evidence suggesting its anticarcinogenic and antitumour properties, there are no available studies on the effects of squalene either on human breast tumour or human mammary epithelial cells. Therefore, the aim of this paper was to investigate squalene’s possible antioxidant effects and their relation to its antiproliferative capacity and oxidative DNA damage protection in both human breast cancer cell lines (MCF7 and MDA-MB-231)

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F. Warleta et al. / Food and Chemical Toxicology 48 (2010) 1092–1100

and an immortalized non-tumourigenic human mammalian epithelial cell line (MCF10A). For this purpose, we studied squalene’s scavenging activity and its effects on cell proliferation, cell cycle profile, apoptosis, intracellular oxidative stress and DNA oxidative damage.

1093

at 37 °C for 160 min in a microplate reader (TECAN GENios Plus). Final results were calculated based on the difference in the area under the fluorescence decay curve (AUC) between the blank and each sample. The AUC formula was:

AUC ¼ 1 þ f1 =f0 þ f2 =f0 þ f3 =f0 þ f4 =f0 þ    þ f20 =f0 : Results were expressed as micromolar Trolox™ equivalents (TE) calculated using the line equation from the standard curve:

2. Materials and methods

TE ¼ ðY  bÞ=m

2.1. Materials

where Y is the net AUC (AUCsample  AUCcontrol), m is the slope and b is the Y-intercept.

The following were purchased from Sigma–Aldrich Co. (St Louis, MO): Hepes Buffer; Sodium Pyruvate; non-essential amino acids mixture 100 (NEAA); 20 ,70 dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA); dimethyl sulfoxide (DMSO); 2,3-bis(2methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt (XTT sodium salt) purity P90%; 5-methylphenazinium methyl sulfate; N-methylphenazonium methyl sulfate (PMS) purity 98%; 2,6,10,15,19,23-hexamethyl2,6,10,14,18,20-tetracosahexane (squalene CAS 111-02-4) purity P98%; DL-all-rac-a-tocopherol (Vitamin E CAS 10191-41-0 (TOC)) purity P96%; 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox™ CAS 53188-07-1 (TR)) purity P97%; 2,20 -azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH) purity 97%; 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) purity 90%; (S)-(+)-camptothecin (CAS 7689-03-4 (CPT)) purity 95%; 2,20 -azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) diammonium salt tablets (CAS 30931-67-0 (ABTS)); PBS; HBSS. Minimum essential medium with Eagle’s salts (MEM), foetal bovine serum (FBS) and phenol-red-free Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) were obtained from PAA Laboratories GmbH (Pasching, Austria). TrypLE Express, HuMEC ready medium kit, fluorescein (FL) and propidium iodide (PI) were obtained from Invitrogen (Eugene, OR). K2S2O8 (CAS 7727-21-1) was obtained from Panreac Quimica S.A.U. (Barcelona, Spain). Culture plates were obtained from NUNCtm (Roskilde, Denmark). The PI/RNase Staining Buffer kit, FITC-conjugated Annexin V and Binding Buffer were obtained from BD Biosciences Pharmigen (San Diego, CA.). The comet assay kit was obtained from Trevigen, Inc. (Helgerman CT, Gaithersburg, MD). 2.2. Estimation of radical scavenging activity by the DPPH test The antioxidant activity of squalene against the stable radical DPPH was measured as previously reported (Brand-Williams et al., 1995) with some modifications. Briefly, 100 lM ethanolic solution of DPPH was mixed with different ethanolic solutions of squalene in 96-well plates at 0.06, 0.13, 0.25, 0.5 and 1 mol of antioxidant/ moles of DPPH. a-Tocopherol (TOC) was used as a standard antioxidant control and a sample without antioxidant was also measured as a blank control. The decrease in absorbance at 520 nm was determined immediately and every 5 min for 2 h in a microplate reader (TECAN, GENios Plus). Measurements were performed in triplicate. The inhibition of the DPPH radical was calculated according to the following percentage of radical scavenging activity (% RSA) formula:

% RSA ¼ ½ðACð0Þ  AAðtÞ Þ=ACð0Þ   100 where AC(0) is the absorbance of the control at t = 0 min and AA(t) is the absorbance of the antioxidant at t = 50 min. 2.3. ABTS radical scavenging assay ABTS cation radical scavenging activity was determined using a previously reported procedure (Re et al., 1999). ABTS radicals (ABTS+) were obtained by ABTS/ H2O 0.5 mM reaction with K2S2O8 for 16 h in the dark at room temperature. ABTS+ was diluted in ultrapure water until absorbance at 734 nm was 0.7 (±0.1). Squalene and Trolox™ (as antioxidant reference) were dissolved in ethanol to yield a 10 mM stock solution and diluted with ultrapure water to the assayed concentrations. Twenty microliters of each concentration of squalene, standard (Trolox™), blank (ultrapure water) or ethanol control (8%) were added to a 96-well plate. The reaction was initiated by the addition of 280 lL of ABTS+. Absorbance readings were taken every 5 min at 30 °C for 2 h in a microplate reader (TECAN, GENios Plus). All determinations were carried out in triplicate. The inhibition of ABTS+ was calculated according to the percentage of radical scavenging activity (% RSA) described above (at t = 30 min). 2.4. ORAC assay Squalene’s peroxyl radical scavenging activity was measured by the ORACFL assay as previously described (Prior et al., 2003). A stock solution of squalene was reconstituted in DMSO and then diluted in PBS. A stock solution of Trolox™, as reference antioxidant control, was also diluted in DMSO and diluted in PBS. The assay was carried out in 96-well plates with a final volume of 160 lL. Samples were run in triplicate. Fluorescein (48 nM) was mixed with various concentrations of squalene, standard (Trolox) or blank (PBS) containing at final volume 1% DMSO (v/v). Plates were incubated for 15 min at 37 °C. The assay was initiated by the addition of AAPH (100 mM), and fluorescence readings (Ex. k485/Em. k520 nm) were taken every 5 min

2.5. Cell culture Highly invasive MDA-MB-231 human breast cancer cells (oestrogen and progesterone receptor-negative), minimally invasive MCF7 human breast cancer cells (oestrogen and progesterone receptor-positive), and immortalized non-tumourigenic human breast epithelial cells (MCF10A), were obtained from American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). Breast tumour cells (MCF7 and MDA-MB-231) were grown as monolayer cultures in MEM supplemented with 10% FBS, 1% Hepes Buffer, 1% Sodium Pyruvate and 1% NEAA. Human mammary epithelial cells (MCF10A) were cultivated in HuMEC Ready Medium. All cell lines were maintained at 37 °C in a humidified atmosphere with 5% CO2. Cells were routinely subcultured using TrypLE Express solution (Invitrogen). Cells in the exponential growth phase were used for all experiments. 2.6. XTT cell proliferation assay Cell proliferation, measured as the cellular growth of treated cells versus untreated controls, was carried out using an XTT-based assay according to Scudiero et al. (1988) with some modifications. Briefly, cells were seeded into 96-well culture plates. After overnight incubation to allow cell attachment, medium was removed and replaced with fresh medium containing squalene at a series of concentrations and plates were incubated for 24, 48 or 120 h followed by a 6 day proliferation period (incubation with fresh medium). At these three time points, plates were incubated with XTT in RPMI without Phenol-Red for 3 h and absorbance was measured at 450 nm wavelength (620 nm as reference) in a plate reader (TECAN GENios Plus). Viability was calculated using the formula:

% viable cells ¼ ½ðAtreated cells Þ=ðAcontrol Þ  100 where A is the difference in absorbance between optical density units (A = OD450  OD620) All measurements were performed in triplicate and each experiment was repeated at least three times. 2.7. Cell cycle assay Cells were seeded in 12-well culture plates and treated with different doses of squalene for 24 h. After incubation, cells were fixed with cold 70% ethanol and stored at 20 °C for at least 24 h. Subsequent to propidium iodide labeling (PI/ RNase Staining Buffer), cells were analyzed by flow cytometry (EPICS XL-MCL, Beckman Coulter, Spain). The FlowJo program (v5.7.2) was used to calculate the percentage of cells in G0/G1, S and G2/M phases. Each experiment was repeated at least three independent times. 2.8. Analysis of apoptosis The percentage of apoptotic cells was determined using a double staining assay with FITC-conjugated Annexin V and propidium iodide (PI). Briefly, after cell exposure to squalene for 24 h, cells were harvested, washed twice in cold PBS and resuspended in 100 lL Annexin Binding Buffer. Cells were stained with 5 lL Annexin V-FITC and 1 lL PI solution, gently vortexed and incubated for 15 min at room temperature in the dark before flow cytometric analysis. As a positive control, cells were treated with 1 lM camptothecin (CPT). Each experiment was repeated at least three independent times. 2.9. Detection of intracellular reactive oxygen species Intracellular reactive oxygen species (ROS) levels were measured after 24 h of treatment with different doses of squalene, or TOC as a positive control, using the cell-permeable fluorescent probe, 20 ,70 -dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA), as previously described (Wang and Joseph, 1999) with some modifications. In brief, after incubation, cells were washed two times with Hank’s buffered salt solution (HBSS) and incubated with fresh DCFH-DA (100 lM) for 30 min at 37 °C in 5% CO2. Cells were then washed twice and read in a plate reader for 30 min (Ex. k485/Em. k535, Gain 60). The intracellular ROS level percentage was calculated as follows:

F ¼ ½ðFt 30  Ft 0 Þ=Ft 0   100 where Ft0 is the fluorescence at t = 0 min and Ft30 the fluorescence at t = 30 min.

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1094

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It has been reported that the addition of H2O2 increases oxidative stress in cultured cells (Lee et al., 2006). Therefore, in order to evaluate the protective capacity of squalene against induced oxidative stress, H2O2 at 500 lM was added 30 min before the fluorescence quantification. All tests were run in triplicate for each experimental condition and each experiment was repeated at least three times. All experiments were conducted using iron-free mediums (MEM and HuMEC). 2.10. Alkaline single-cell gel electrophoresis (comet assay) At 24 h, cells treated with squalene were scraped into 12-well culture plates, washed twice (300g 10 min, 4 °C) with cold 1X PBS (Ca2+/Mg2+ free) and then resuspended in 1 ml of cold 1X PBS. In order to evaluate squalene’s ability to protect against oxidative DNA damage, cell suspensions were exposed for 10 min to 50 lM H2O2 at 4 °C. After that, cells were washed twice and frozen in FBS-DMSO (90:10, v/v) at 80 °C until the comet assay procedure. DNA single strand break by alkaline microgel electrophoresis was performed according to Singh et al. (1988) with some modifications. Cells were thawed in a bath at 37 °C, centrifuged (300g 10 min, 4 °C) in cold MEM with 25% FBS and resuspended in cold 1X PBS to a density of 1.65  105 cells/ml. Cells were then suspended in melted and cooled (at 40 °C) low melting point agarose (LMA). Cell suspensions (50 lL) were spread over a sample area of pre-warmed 1% normal melting point agarose (NMA) precoated CometSlideTM slides (Trevigen, Inc.). After 15 min at 4 °C in the dark, slides were immersed in cold Lysis Solution (Trevigen, Inc.) at 4 °C for 30 min to dissolve lipids and proteins. In order to separate the two DNA strands, slides were then immersed in fresh Alkaline Solution (pH > 13) for 30 min at room temperature in the dark. Electrophoresis was performed in a refrigerated black electrophoresis tank containing cold Alkaline Electrophoresis Solution (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH > 13) at 25 V (1 V/cm) and 300 mA for 40 min. The slides were washed twice with distilled water for 10 min and neutralized with 10 mM Tris–HCl, pH 7.5 for 5 min, followed by immersion in 70% ethanol for 5 min, and air-dried overnight at room temperature. Slides were stained with Sybr green before scoring.

0.00 0.25

0.13 1.00

Olive TM ¼ ½ðtailðmeanÞ  headðmeanÞÞ  tailð% DNAÞ=100:

2.12. Statistical analysis Results are presented as mean (±SEM), except for cell proliferation results. For this assay, results are presented as mean (±SD). Results are expressed as a percentage relative to the control, which was defined as 100%. Statistical analysis was performed using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Fisher’s LSD test. Values of p < 0.05 were considered significant. STATGRAPHICS Plus 5.1 statistical software (Statpoint Technologies, Inc., Warrenton, Virginia, USA) was used for the statistical analysis.

3. Results 3.1. Antioxidant activity Radical scavenging capacity was determined using DPPH, ABTS and ORAC assays. The antiradical activity of squalene, as measured by scavenging activity in the DPPH radical assay (Fig. 1A) or in the ABTS cationic radical assay (Fig. 2A), indicates that squalene at up to 10 mol ratio [mole antioxidant/mole DPPH] does not possess antiradical activity, nor does it possess such activity at up to 800 lM. TOC

A

0 μM 25 μM 200 μM

0.800 0.600

0.600 0.400 0.200 0.000 0

20

B

40

0.00 0.25

60 80 Time (min)

100

0.06 0.50

120

0.13 1.00

0.300 0.200 0.100 0

20

B 0.600

0.600

0.500

0.200

12.5 μM 100 μM 800 μM

0.400

0.800

0.400

6.25 μM 50 μM 400 μM

0.500

0.000

Abs (734 nm)

Absorbance at 520 nm

0.06 0.50

DNA strand breaks were examined in a fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200) equipped with Luca EMCCD camera (Andor Technology, Belfast, UK) under 494 nm excitation and 521 nm emission wavelength using the Komet 5.5 software package (Kinetic Imaging Ltd., Liverpool, UK). Fifty cell images were randomly characterized per sample using 20 magnification. Relative fluorescence between head and tail through the olive tail moment (Olive_TM) was used to determine DNA damage. Olive_TM is defined as the product of the Tail Moment Length and the fraction of DNA in the tail.

Abs (734 nm)

Absorbance at 520 nm

A

2.11. Slide scoring and analysis

40

60 80 Time (min)

0 μM 200 μM

50 μM 400 μM

40

60 80 Time (min)

100

120

100 μM 800 μM

0.400 0.300 0.200 0.100

0.000 0

20

40

60 80 Time (min)

100

120

Fig. 1. Radical scavenging activity was measured by the reduction of the DPPH radical (100 lM) by ethanolic solutions of squalene (A) or a-tocopherol (TOC) (B) for a period of 120 min. The mole ratios [mole antioxidant/mole DPPH] assayed were between 0.06 and 1. The relative radical scavenging activity (RSA) of squalene at 50 min was 65% even at higher ratios (2.50, 5.00 and 10.00) (data not shown) while the RSA of Trolox™ was 50% at 0.16 mol ratio.

0.000

0

20

100

120

Fig. 2. ABTS radical cation (ABTS+) antioxidant activity of ethanolic solutions of squalene (A) or Trolox™ (B) up to 800 lM were measured by decolorization of ABTS+ for 120 min. Relative radical scavenging activity (RSA) for all assayed concentrations of squalene at 30 min was <4% while the RSA of Trolox™ reached 50% at 143.57 lM.

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120

0 μM 3.12 μM 6.25 μM 12.5 μM 25 μM 50 μM 100 μM 200 μM 400 μM

100 80

60 40 20

3.5. Effect of squalene on intracellular ROS production

20

40

60 80 100 120 140 160 Time (min)

Relative fluorescence

B 120

0 μM 12.5 μM 25 μM 50 μM 100 μM

100 80 60

40 20 0

0

20

40

60 80 100 Time (min)

120

140

160

Fig. 3. Peroxyl antiradical activity was performed by the ORACFL assay on a range of concentrations of squalene from 3.12 to 400 lM (A) or Trolox™ from 12.5 to 100 lM (B) for 160 min. Results show how squalene failed to reduce the AAPHinduced peroxyl radical at all assayed concentrations compared with Trolox™. TE for any one of the squalene concentrations assayed was close to zero, indicating the absence of peroxyl scavenging activity (data not shown).

and Trolox were used as antioxidant standard controls for the DPPH (Fig. 1B) and ABTS (Fig. 2B) assays, respectively. Squalene’s peroxyl radical scavenging activity, measured by the ORACFL assay, shows the absence of a protective effect against AAPH-induced peroxyl radical activity (Fig. 3A), as compared with Trolox’s antiradical activity (Fig. 3B). 3.2. Effect of squalene on cell proliferation To observe the effect of squalene on both human breast cancer cell lines (MCF7 and MDA-MB-231) and on the immortalized nontumourigenic human mammary epithelial cell line (MCF10A), cells were treated with various concentrations of squalene ranging from 3.12 to 50 lM for 24, 48 and 120 h. Squalene had no significant effect on the cell proliferation rates of both MCF7 and MCF10A cells (Fig. 4A and C). Unexpectedly, a slight increase in MDA-MB-231 cell proliferation was observed, although it was not statistically significant (Fig. 4B). 3.3. Effect of squalene on the cell cycle A flow cytometry assay after PI staining allows cell cycle analysis. MCF7, MDA-MB-231 and MCF10A cells were treated with 12.5, 50 and 200 lM squalene to evaluate interference with the cell cycle. The results revealed that after 24 h of squalene treatment, no significant effect was observed on the cell cycle in any one of the three cell lines tested (data not shown). 3.4. Effect of squalene on apoptosis The extent of apoptosis was assessed by flow cytometry analysis following 24 h exposure of cells to different doses of squalene

Measurement of intracellular ROS levels using the DCFH-DA probe showed a significant and dose-dependent decrease in ROS levels in MCF10A cells after 24 h treatment with increasing concentrations of squalene from 3.12 to 50 lM. At the highest concentration (50 lM), squalene reduced ROS production by more

A Cell proliferation (relative to control)

0

MCF 7

B

MDA

MCF 10A

160% 140% 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 0

Cell proliferation (relative to control)

0

(12.5, 50 and 200 lM). Apoptosis was detected using Annexin-VFITC (AV) and PI labeling. The percentage of apoptotic cells was calculated from the ratio of the sum of early plus late apoptotic cells to all cells (apoptotic and whole cells). Flow cytometric analysis revealed that treatment with squalene for 24 h did not induce apoptosis in human breast epithelial cells (MCF10A), nor did it induce apoptosis in human breast cancer cells (MCF7, MDA-MB231), when compared with controls (data not shown).

3.12

MCF 7

6.25 12.5 SQ (μM) MDA

25

50

MCF 10A

160% 140% 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 0

C Cell proliferation (relative to control)

Relative fluorescence

A

3.12

MCF 7

6.25 12.5 SQ (μM) MDA

25

50

MCF 10A

160% 140% 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 0

3.12

6.25 12.5 SQ (μM)

25

50

Fig. 4. In vitro cell proliferation of MCF7, MDAMB-231 and MCF10A cell lines after squalene (SQ) treatment was determined by colorimetric XTT-based assay at 24 h (A), 48 h (B) and 120 h (C). Although MDA-MB-231 showed a slight increase in cell proliferation, no difference at p < 0.05 was detected in any cell line. Higher concentrations of squalene up to 400 lM showed similar effects (data not shown). Values represent the mean ± SD of three independent experiments and are expressed as a percentage of the control, which was defined as 100%.

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A

MCF 7

160%

MDA

MCF10A

ROS level (relative to control)

140% 120% 100% 80% *

60%

*

40%

* *

20% 0% 0

B

3.12

6.25 12.5 SQ (μM)

MCF7

160%

25

MDA

50

MCF10A

ROS level (relative to control)

140% 120% 100%

† #

80%

† #

† #

† #

† #

*

*

*

25

50

60% 40% *

20% *

0% 0

3.12

6.25 12.5 TOC (μM)

Fig. 5. Intracellular ROS levels were measured by DCFH-DA probe in MCF7, MDA-MB-231 and MCF10A cell lines after treatment with squalene (SQ) (A) or a-tocopherol (TOC) (B) for 24 h. Squalene significantly decreased intracellular ROS levels, in a dose-dependent manner, in MCF10A cells but not in MCF7 and MDA-MB-231 cells. TOC significantly decreased the intracellular ROS level in a dose-dependent manner in both breast cancer and mammary epithelial cell lines. Results are displayed as mean ± SEM for three independent experiments. Significant differences were determined relative to the control, which was considered to be 100%, at p < 0.05 (  MCF7, # MDA-MB-231, * MCF10A) using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Fisher’s LSD test.

than 50% compared with the untreated control. Interestingly, squalene did not change intracellular ROS levels for either of the human breast cancer cell lines tested (MCF7, MDA-MB-231) (Fig. 5A). TOC, used as an antioxidant reference compound, exhibited a significant decrease in ROS levels, with a greater than 50% reduction compared with untreated cells in each of the cell lines assayed (MCF10A, MCF7 and MDA-MB-231) (Fig. 5B). To induce intracellular oxidative stress, H2O2 was added before fluorescence measurement. H2O2 induces oxidative injury on MCF7, MDA-MB-231 and MCF-10A cells in vitro (data not shown). In order to investigate the in vitro preventive effect of squalene against H2O2 oxidative injury, intracellular ROS levels were measured in cells previously treated with squalene for 24 h at increasing concentrations from 3.12 to 50 lM. Interestingly, whereas squalene did not prevent oxidative stress injury in MCF7 and MDA-MB-231 breast tumour cells, MCF10A epithelial cells showed a significant decrease (up to 60% reduction) in intracellular ROS levels, in a dose-dependent manner (Fig. 6A). In contrast, at even the lowest concentration (3.12 lM), TOC was able to reduce oxidative injury in both the tumour cells and the epithelial cells (Fig. 6B). However, squalene was more effective at reducing oxidative injury to MCF10A epithelial cells than TOC.

3.6. Preventive effect of squalene against oxidative DNA damage We measured the preventive effect of squalene against H2O2-induced DNA damage in MCF10A, MCF7 and MDA-MB-231 cells using alkaline single-cell gel electrophoresis (comet assay). Squalene’s potential to reduce oxidative DNA damage was expressed as Olive_TM. Olive_TM incorporates a measure of both the smallest detectable size of migrating DNA (reflected in the comet tail length) and the number of relaxed/broken pieces (represented by the intensity of DNA in the tail) (Singh et al., 1988). Pre-incubation of MCF10A cells with increasing concentrations of squalene for 24 h exerted a significant, dose-dependent preventive effect against H2O2-induced DNA damage (p < 0.001) (Fig. 7A). However, squalene did not show any preventive effect against the formation of single-strand breaks in MCF7 and MDA-MB-231 tumour cells. An increase in oxidative DNA damage was observed in the MDA-MB-231 cell line, but this increase was not statistically significant (p = 0.23) (Fig. 7B). 4. Discussion Case control studies have shown an inverse correlation between olive oil consumption and the incidence of breast cancer (Escrich

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A

MCF7

160%

MDA

MCF10A

ROS level (relative to H2O2 control)

140% 120% 100% 80% 60% *

40%

*

20%

*

*

*

25

50

0% 0

B

3.12

6.25 12.5 SQ (μM)

MCF7

160%

MDA

MCF10A

ROS level (relative to H2O2 control)

140% 120%

† #

100%

† #

80%

† #

† #

† #

*

*

*

25

50

60% 40%

* *

20% 0% 0

3.12

6.25 12.5 TOC (μM)

Fig. 6. The capacity of squalene (SQ) (A) or a-tocopherol (TOC), as antioxidant control (B), to reduce an oxidative burst induced by the addition of H2O2 (500 lM) on MCF7, MDA-MB-231 or MCF10A cell lines was measured by DCFH-DA probe. Squalene prevented the oxidative injury induced in MCF10A cells, in a dose-dependent manner, but this preventive effect was not observed in MCF7 and MDA-MB-231 cells. Interestingly, TOC significantly reduced oxidative injury in all three cell lines, even at the lowest concentration (3.12 lM). Results are expressed as mean ± SEM for three independent assays. Significant differences were determined relative to the positive control (treated with H2O2), which was defined as 100%, at p < 0.05 (  MCF7, # MDA-MB-231, * MCF10A) using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Fisher’s LSD test.

et al., 2006; Owen et al., 2000a). It has been suggested that the lower risk of breast cancer associated with olive oil consumption may be due to squalene (Newmark, 1997), a minor compound present in virgin olive oil in quantities as high as 13,000 mg/kg (Allouche et al., 2007). The average daily dietary intake of squalene in Mediterranean countries is in the range of 200–400 mg/day (Sotiroudis and Kyrtopoulos, 2008). Experiments in rodents suggest that squalene exhibits antitumour activity against skin, colon, sarcoma and lung cancer (Murakoshi et al., 1992; Ohkuma et al., 1983; Rao et al., 1998; Smith et al., 1998). It has also been shown that squalene inhibits the in vitro growth of neuroblastoma cells (Das et al., 2003). The mechanism proposed to explain the activity of squalene is based on its strong inhibitory action on beta-hydroxy-beta-methylglutaryl-CoA reductase catalytic activity in vivo. This activity affects Ras p21 farnesylation, signal transduction and cellular proliferation (Newmark, 1997). Nevertheless, very little is known about the effect of squalene on human breast tumourigenesis. Our data suggest that squalene treatment did not exert any significant influence on MCF10A, MCF7 and MDA-MB-231 cell proliferation. (We did observe a slight increase in MDA-MB-231 cell proliferation, but the increase was not statistically significant.) Das et al. (2008) have hypothesized that squalene might support

the growth of a small fraction of tumour stem cell-like cells having a very high tumourigenic capacity after cisplatin treatment. In addition, it has been reported that at low-doses, certain antioxidants can stimulate the growth of some types of cancer. For example, vitamin C was found to stimulate the growth of both human parotid carcinoma cells and human leukemic cells in vitro (Prasad et al., 2001), and vitamin E was found to enhance the growth of various prostate cancer cell lines (Bureyko et al., 2009). Beta-carotene, an antioxidant structurally similar to squalene, increased the incidence of lung cancer among male heavy cigarette smokers (Paolini et al., 2003). Future work is needed to clarify the mechanisms of stimulation of cancer cell growth by some antioxidants. In the present study, the effect of squalene on the cell cycle profile and cell apoptosis was also studied. Incubation of MCF10A, MCF7 and MDA-MB-231 cells for 24 h with squalene did not alter the cell cycle parameters, nor did it induce cell apoptosis. Overall, these results suggest that squalene does not induce breast tumour cell death and may be ineffective once a breast tumour is established. Squalene has long been considered to be an antioxidant exerting anticarcinogenic activity by enhancing cellular antioxidant status (Hashim et al., 2005; Murakoshi et al., 1992; Smith, 2000). However, very little is known about its scavenging capacity. Our

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A

160%

Olive_TM (relative to H2O2 treated cells)

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140%

MCF10A 120% 100% 80%

*

*

+ 50

+ 100

*

60% 40% 20% 0%

B

160%

Olive_TM (relative to H2O2 treated cells)

0

140%

+ 0

+ 10

MCF7

+ 200

H 2O 2 SQ (μM)

MDA-MB-231

120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 0

+ 0

+ 50

+ 200

H 2O 2 SQ (μM)

Fig. 7. A comet assay was performed in order to determine the preventive effect of squalene (SQ) in DNA oxidative damage in the MCF10 cell line (A) or MCF7 and MBA-MB231 cell lines (B). Squalene reduces single-strand breaks, in a dose-dependent manner, in MCF10A cells, but not in MCF7 and MBA-MB-231 cells. Olive_TM values are represented by mean ± SEM for three independent assays. Significant differences were determined relative to the positive control (treated only with H2O2), which was defined as 100%, at *p < 0.05 using one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Fisher’s LSD test.

results showed that squalene did not exert antioxidant activity against DPPH stable radicals, ABTS cation radicals or APPH-induced peroxyl radicals, even at high concentration (10.00 mol ratio, 800 lM and 400 lM, respectively) (Figs. 1–3). Concomitantly, it has also been reported that squalene reacts very poorly with DPPH (EC50 at 980 mol ratio) (Psomiadou and Tsimidou, 1999), and has a very low ORAC value (0.00062), suggesting that squalene’s antioxidant activity is extremely low (Tikekar et al., 2008). Squalene’s lack of ABTS scavenging capacity has not been described previously. In contrast, Kohno et al. (1995) reported squalene to be a singlet oxygen quencher capable of protecting the skin from UV radiation. The plasma membrane is permeable to squalene, enabling squalene to move inside the lipid bilayer and act as a quencher barrier for singlet oxygen, consequently preventing intracellular oxidative damage. Differential squalene permeability between tumour and non-tumour mammary cells could provide a possible explanation for these contrasting results, but the evidence at this point is inconclusive. Squalene has been found to exert protective activity against several cancers associated with specific carcinogens, including azoxymethane-induced colon cancer (Rao et al., 1998) and nicotine-derived nitrosaminoketone-induced lung carcinogenesis (Smith et al., 1998). In the present study, the DCFH-DA assay indicated that squalene has differential antioxidant activity in human

breast cells, since it significantly decreased, in a dose-dependent manner, intracellular ROS levels in MCF10A cells (57.71% at 50 lM) but not in MCF7 or MDA-MB-231 cells (104.87% and 99.92% at 50 lM, respectively). This selective effect of squalene was also described by Das et al. (2008), although in other cell types. These authors found that squalene decreased ROS levels in bone marrow cells but not in neuroblastoma cells (SK-N-BE tumour cell line). In contrast, the well-known antioxidant TOC, used as the reference in the present study, did not show this selective effect; it reduced the oxidative stress by 58.84%, 53.78% and 64.20% at 50 lM in MCF10A, MCF7 and MDA-MB-231 cells, respectively. Consequently, our results suggest that breast cancer cells and breast epithelial cells have the same response to TOC treatment, but that squalene acts as an antioxidant only on mammary epithelial cells. Taking into account that the mechanism of such selective antioxidant sensitivity is unknown, we may consider the following possibilities: (i) it is possible that squalene selectively increases glutathione (GSH) level in normal cells but not in breast cancer cells, a phenomenon described as the ‘‘GSH paradox” (Das et al., 2003); (ii) the selective sensitivity might be related to differences in cellular uptake and accumulation of squalene, or the status of the mevalonate pathway (Das et al., 2008); (iii) the selective sensitivity might be related to the differential regulation of antioxidant systems in normal versus tumour cells (Klauning and Kamendulis,

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2004). Tumour cells may be in an environment of continuous oxidative stress, in which antioxidants may act as pro-oxidants. In fact, in the present study we found that breast cancer cells have higher intracellular ROS levels than non-tumourigenic mammary epithelial cells (data not shown). Further studies should be done to address these topics. Oxidative stress may result in an increase in oxidative damage and can be caused either by an overproduction of free radicals and ROS or by an impairment of the endogenous antioxidant system. It is known that a chronic increase in ROS and oxidant stress may induce cancer (Ambrosone, 2000). Reactive oxygen species can damage cellular macromolecules, including DNA, and this damage is directly responsible for carcinogenesis. Thus, it has been shown that neoplastic transformation is associated with an increase in the basal oxidant level. In fact, serum markers for oxidative DNA damage have been shown to increase in women diagnosed with breast cancer (Musarrat et al., 1996). Considering that oxidative stress is involved in the pathophysiology of all cancers (Visioli et al., 2004), the prevention of oxidative stress on mammary cells could be a suitable way to prevent breast cancer development. In the present work, we found that H2O2-induced oxidative injury increases ROS levels in both human mammary epithelial cells and breast cancer cells as measured by the DCFH-DA assay (data not shown). Interestingly, squalene was able to prevent, in a dose-dependent manner, induced oxidative injury in human breast epithelial cells but not in human breast cancer cells. It has been postulated that neoplastic transformation is associated with an increase in the basal level of oxidant stress; therefore, it may be presumed that squalene might help to prevent human breast cancer by reducing oxidative stress on mammary epithelial cells. The comet assay provides information about DNA damage through quantification of single-strand breaks. We used this technique to determine the protective effect of squalene against DNA damage induced by H2O2 oxidative injury. As observed in the DCFH-DA assay, squalene exhibited selective activity according to the cell line. It reduced oxidative DNA damage in a dose-dependent manner in MCF10A mammary epithelial cells, but failed to reduce oxidative injury in MCF7 and MDA-MB-231 breast cancer cells. In the latter, injury was even slightly increased after squalene treatment. Therefore, these results suggest that squalene might be helpful in human breast cancer prevention, but not treatment, based on two hypotheses: (i) it reduces oxidative stress by decreasing ROS levels in mammary epithelial cells, and (ii) it selectively protects against oxidative DNA damage in mammary epithelial cells. In addition, these findings could support the hypothesis that high squalene intake could contribute to the lower incidence of breast cancer in Mediterranean populations. It is important to note that adipose tissue contains exceptionally high concentrations of squalene relative to other tissues (Tilvis et al., 1982). Considering that mammary glands include much adipose tissue, it may be presumed that squalene levels could also be high in breast tissues. In summary, we found that mammary epithelial cells and breast tumour cells differed in their responses to squalene treatment. Our results indicated that squalene reduces in vitro ROS levels and protects against oxidative DNA damage in human mammary epithelial cells but not in breast tumour cells. Therefore, squalene, present at high concentrations in virgin olive oil, might contribute to the preventive effect of olive oil against human breast cancer by inhibiting oxidative stress. Moreover, our in vitro results suggest that squalene may play a role in the prevention of human breast cancer, but is probably ineffective once breast tumours are established. Nevertheless, extreme caution should be applied in the extrapolation of in vitro results to potential human effects. Further studies are needed to confirm both the in vivo protective capacity of squa-

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lene and the differential mechanism of action on normal versus breast cancer cells suggested by the present study. Conflict of interest The authors declare that there are no conflicts of interest. Acknowledgements This study was supported by the ‘‘Ministerio de Ciencia e Innovación” (RTA2008-00066-C03-03); ‘‘Instituto Andaluz de Biotecnología” (BIOÁNDALUS 08/22/L5.3); and; ‘‘Centro de Excelencia en Investigación sobre Aceite de Oliva y Salud” (CEAS). References Allouche, Y., Jiménez, A., Gaforio, J.J., Uceda, M., Beltrán, G., 2007. How heating affects extra virgin olive oil quality indexes and chemical composition. J. Agric. Food Chem. 55, 9646–9654. Ambrosone, C.B., 2000. Oxidants and antioxidants in breast cancer. Antioxid. Redox Signal. 2, 903–917. Brand-Williams, W., Cuvelier, M.E., Berset, C., 1995. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensm. Wiss. Technol. 28, 25–30. Bureyko, T., Hurdle, H., Metcalfe, J.B., Clandinin, M.T., Mazurak, V.C., 2009. Reduced growth and integrin expression of prostate cells cultured with lycopene, vitamin E and fish oil in vitro. Br. J. Nutr. 101, 990–997. Cert, A., Moreda, W., Pérez-Camino, M.C., 2000. Chromatographic analysis of minor constituents in vegetable oils. J. Chromatogr. A 881, 131–148. Das, B., Yeger, H., Baruchel, H., Freedman, M.H., Koren, G., Baruchel, S., 2003. In vitro cytoprotective activity of squalene on a bone marrow versus neuroblastoma model of cisplatin-induced toxicity: implications in cancer chemotherapy. Eur. J. Cancer 39, 2556–2565. Das, B., Antoon, R., Tsuchida, R., Lofti, S., Morozova, O., Farhat, W., Malkin, D., Koren, G., Yeger, H., Baruchel, S., 2008. Squalene selectively protects mouse bone marrow progenitors against cisplatin and carboplatin-induced cytotoxicity in vivo without protecting tumor growth. Neoplasia 10, 1105–1119. Escrich, E., Ramírez-Tortosa, M.C., Sánchez-Rovira, P., Colomer, R., Solanas, M., Gaforio, J.J., 2006. Olive oil in cancer prevention and progression. Nutr. Rev. 64, S40–S52. Hashim, Y.Z.H., Gill, C.I.R., McGlynn, H., Rowland, I.R., 2005. Components of olive oil and chemoprevention of colorectal cancer. Nutr. Rev. 63, 374–386. Katdare, M., Singhal, H., Newmark, H., Osborne, M.P., Telang, N.T., 1997. Prevention of mammary preneoplastic transformation by naturally-occurring tumor inhibitors. Cancer Lett. 111, 141–147. Klauning, J.E., Kamendulis, L.M., 2004. The role of oxidative stress in carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 239–267. Kohno, Y., Egawa, Y., Itoh, S., Nagaoka, S., Takahashi, M., Mukai, K., 1995. Kinetic study of quenching reaction of singlet oxygen and scavenging reaction of free radical by squalene in n-butanol. Biochim. Biophys. Acta 28, 52–56. Lee, D.H., Lim, B.S., Lee, Y.K., Yang, H.C., 2006. Effects of hydrogen peroxide (H2O2) on alkaline phosphatase activity and matrix mineralization of odontoblast and osteoblast cell lines. Cell Biol. Toxicol. 22, 39–46. Murakoshi, M., Nishino, H., Tokuda, H., Iwashima, A., Okuzumi, J., Kitano, H., Iwasaki, R., 1992. Inhibition by squalene of the tumor-promoting activity of 12O-tetradecanoylphorbol-13-acetate in mouse-skin carcinogenesis. Int. J. Cancer 52, 950–952. Musarrat, J., Arezina-Wilson, J., Wani, A.A., 1996. Prognostic and etiological relevance of 8-hydroxyguanosine in human breast carcinogenesis. Eur. J. Cancer 32, 1209–1214. Newmark, H.L., 1997. Squalene, olive oil, and cancer risk: a review and hypothesis. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 6, 1101–1103. Ohkuma, T., Otagiri, K., Tanaka, S., Ikekawa, T., 1983. Intensification of host’s immunity by squalene in sarcoma 180 bearing ICR mice. J. Pharmacobiodyn. 6, 148–151. Owen, R.W., Giacosa, A., Hull, W.E., Haubner, R., Würtele, G., Spiegelhalder, B., Bartsch, H., 2000a. Olive-oil consumption and health: the possible role of antioxidants. Lancet Oncol. 1, 107–112. Owen, R.W., Mier, W., Giacosa, A., Hull, W.E., Spiegelhalder, B., Bartsch, H., 2000b. Phenolic compounds and squalene in olive oils: the concentration and antioxidant potential of total phenols, simple phenols, secoiridoids, lignans and squalene. Food Chem. Toxicol. 38, 647–659. Paolini, M., Abdel-Rahman, S.Z., Sapone, A., Pedulli, G.F., Perocco, P., Cantelli-Forti, G., Legator, M.S., 2003. Beta-carotene: a cancer chemopreventive agent or a cocarcinogen? Mutat. Res. 543, 195–200. Pérez-Jiménez, F., Álvarez de Cienfuegos, G., Badimon, L., et al., 2005. In: International Conference on the Healthy Effect of Virgin Olive Oil. Consensus Report. Jaén 2004. Eur. J. Clin. Invest. 35, 421–424. Prasad, K.N., Cole, W.C., Kumar, B., Prasad, C., 2001. Scientific rationale for using high-dose multiple micronutrients as an adjunct to standard and experimental cancer therapies. J. Am. Coll. Nutr. 20, 450S–463S.

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2010 JCR Science Edition

Rank in Category: FOOD AND CHEMICAL TOXICOLOGY Journal Ranking For 2010, the journal FOOD AND CHEMICAL TOXICOLOGY has an Impact Factor of 2.602. This table shows the ranking of this journal in its subject categories based on Impact Factor. Category Name

FOOD SCIENCE & TECHNOLOGY TOXICOLOGY

Total Journals Journal Rank Quartile in Category in Category in Category

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16

Q1

83

32

Q2

Category Box Plot For 2010, the journal FOOD AND CHEMICAL TOXICOLOGY has an Impact Factor of 2.602. This is a box plot of the subject category or categories to which the journal has been assigned. It provides information about the distribution of journals based on Impact Factor values. It shows median, 25th and 75th percentiles, and the extreme values of the distribution.

Key

FOOD A - SCIENCE & TECHNOLOGY B - TOXICOLOGY

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Las células tumorales circulantes (CTCs) son células que se han desprendido del tumor primario y circulan por el torrente sanguíneo. La existencia de estas células se conoce desde 1869, cuando fueron detectadas por primera vez en un paciente con cáncer de próstata metastásico, y a principios del s. XXI se demostró su carácter maligno y que tienen capacidad metastásica. Actualmente se está evaluando el valor pronóstico que tiene la detección de las CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer, y si sería recomendable utilizarla como un marcador pronóstico independiente de la enfermedad. En esta tesis presento el desarrollo de una metodología que inicialmente solo permitió el aislamiento y cuantificación de las CTCs en sangre periférica de pacientes con tumores sólidos epiteliales, y que posteriormente fue modificada y posibilitó analizar estas células tumorales tanto genética como fenotípicamente. Además expongo el valor pronóstico que tiene la detección de CTCs en sangre periférica de pacientes con cáncer de mama, tanto sobre el tiempo libre de enfermedad como en la supervivencia, y cómo la detección de estas células tumorales señala a una población de pacientes con un mal pronóstico de la enfermedad en los que se incluyen pacientes cuyo tumor primario es ER+. También incluyo los resultados preliminares de un estudio realizado en pacientes con cáncer de colon no metastásico donde, aunque parece que este marcador no tiene un valor predictivo, el hecho de emplear una técnica tan versátil como la desarrollada en 2008 me ha permitido comprobar que las CTCs aportan una información diferente y complementaria a la que ofrece el estudio anatomopatológico del tumor primario.

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